胶质母细胞瘤耐药与复发关键机制曝光：USP10拮抗DTX3L，稳定SATB2

   胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具破坏性的脑肿瘤。GBM的标准治疗是手术，随后进行放疗和化疗。尽管其他实体肿瘤治疗取得了显著进展，但GBM患者的预后依然黯淡，患者的中位生存期仍不足16个月。 GBM的恶性特征被认为与胶质瘤干细胞（GSCs）有关，针对GSCs的新治疗策略开发有望带来重要见解，提升GBM治疗的疗效。

   特殊富含AT的序列结合蛋白2（SATB2）是一种核基质相关的转录因子，与DNA的核基质连接区相互作用，从而调控染色质重塑和基因转录。在GBM中，SATB2在GBM组织中高表达，而与低级胶质瘤相比，且主要富集于GSCs中19.SATB2的破坏显著抑制GSC的增殖和自我更新。此外，SATB2在GBM进展中起关键作用，并显著促进了替莫唑胺和放疗耐药的发展。然而，GSCs中SATB2失调的具体机制仍不明确。

   泛素-蛋白酶体系统是非溶酶体蛋白酶解细胞内蛋白的主要途径。泛素化是一种标记蛋白质降解的过程，在这一调控机制中起着关键的支持作用。这一过程是可逆的，可以通过一类被称为去泛素酶的多种酶介导。USP10是泛素特异性蛋白酶（USP）家族的成员。最近一项研究表明，USP10的破坏可诱导GBM细胞凋亡，并抑制前神经向间充质的过渡，这是GBM进展中的关键过程。Deltex E3泛素连接酶3L（DTX3L）是一种属于Deltex家族的E3泛素连接酶，与多种癌症的发生和发展有关。然而，USP10和DTX3L在GSC生物学中的功能作用仍然很大程度上是个谜。

   该研究2026年1月发表在《Nature Communications》，影响因子：15.7。

技术路线：

主要研究结果：

1、USP10和DTX3L与GSC中的SATB2相互作用

   为了确定SATB2蛋白是通过泛素-蛋白酶体途径降解还是溶酶体降解途径被降解，作者首先在使用环己酰胺（CHX）阻断新生蛋白合成后，检测了两种患者来源的GSC中的SATB2蛋白水平。作者发现SATB2蛋白水平以时间依赖性方式下降。相反，在蛋白酶体抑制剂MG-132治疗后，SATB2的蛋白质水平逐渐升高。然而，在用溶酶体抑制剂巴非洛霉素A1处理后，SATB2的蛋白质水平保持不变。这些结果表明SATB2的降解是通过泛素蛋白酶体系统介导的。为识别调控SATB2泛素化和稳定性的潜在去泛素酶和泛素连接酶，作者进行了质谱分析了抗Myc抗体从过度表达Myc标记SATB2的GSC中提取的SATB2相互作用蛋白。值得注意的是，在潜在SATB2结合伴侣的候选中，作者鉴定出了去泛素酶USP10和E3泛素连接酶DTX3L（图1a、b）。

   为验证SATB2与USP10或DTX3L之间的相互作用，作者在与Myc标签共表达SATB2、与Flag标签共表达的细胞中进行了共免疫沉淀（CoIP）实验HEK293T。CoIP检测显示，外源性USP10或DTX3L在外源性SATB2拉下复物中易于检测，反之亦然（图1c–f）。这些相互作用通过显示内源性USP10或DTX3L可在GSCs内源性SATB2的免疫沉淀中被检测得到证实（图1g）。为了确定SATB2-USP10或SATB2-DTX3L相互作用所需的具体区域，作者生成了多种截断突变体的SATB2-Myc、USP10-Flag和DTX3L-Flag（图1h–j）。CoIP检测显示，SATB2（氨基酸232–437）的中心结构域与USP10（氨基酸401–798）的C端USP结构域是相互作用的必要条件。此外，作者的结果还表明，SATB2（氨基酸232–437）和DTX3L（氨基酸201–554）的中心结构域对它们的相互作用是必要的（图1m，n）。综合来看，这些数据表明去泛素酶USP10和E3泛素连接酶DTX3L与GSCs中的SATB2相互作用，表明USP10和DTX3L可能调控SATB2的稳定性。

图1：USP10和DTX3L与SATB2相互作用。

2、USP10和DTX3L优先由GSC表示

   考虑到SATB2被报道为GSC优先表达。随后，作者旨在验证USP10和DTX3L是否也主要由GBM中的GSC表达。最初在五对匹配的GSCs和非干肿瘤细胞（NSTC）中检测了USP10和DTX3L的蛋白表达。免疫印迹（IB）分析显示，与匹配NSTCs相比，USP10和DTX3L在GSCs中更为突出（图2a）。此外，GSCs中SATB2的富集（图2a），与作者之前的研究结果一致。此外，qPCR分析还显示，GSCs的USP10和DTX3L的mRNA水平表达远高于NSTCs（图2b，c）。接着作者比较了USP10和DTX3L的表达，结果显示USP10在GSC中的表达显著高于DTX3L（图2d）。由于去泛素酶和E3泛素连接酶对蛋白质稳定性具有受阻作用，USP10表达高于DTX3L可能解释了GSCs中SATB2的丰富表达。免疫荧光染色显示，USP10和DTX3L主要位于细胞质中，而SATB2主要存在于GSCs的细胞核中（图2e，f）。这一观察表明，细胞质上的SATB2在去泛素化后可能被转移到细胞核。为验证该假设，作者首先在GSCs中对MG-132或DMSO处理后的SATB2进行了免疫荧光染色。随后，为了确认GSC在GBM中USP10和DTX3L的优先表达，作者考察了多种人类GBM肿瘤中USP10和DTX3L的表达模式。数据确认USP10和DTX3L在表达GSC标记SOX2的胶质瘤细胞中优先表达（图2g、h）。此外，USP10和DTX3L在人类原发性GBM中均与SATB2共定位（图2i、j）。综合来看，这些数据表明，在人类GBM肿瘤中，USP10和DTX3L均由GSC优先表达。

图2：USP10和DTX3L在GBM中由GSC优先表达。

3、USP10是GSC自我更新和GSC驱动肿瘤生长的必要条件

   由于USP10在GSCs中富集，作者通过使用两个独立的靶向USP10的shRNA，探讨了USP10在GSC维持和GSC驱动肿瘤生长中的作用。如预期，两种独立的USP10 shRNA的lentiviral介导表达显著降低了GSCs中的USP10蛋白水平，同时也显著降低了SATB2蛋白水平（图3a）。FOXM1是一个重要的下游靶点，介导SATB2促进的GSC增殖和自我更新。由于SATB2对GSC维持至关重要，USP10破坏导致SATB2蛋白表达减少可能影响GSC功能。作者的数据表明，沉默USP10显著抑制了GSC生长（如细胞滴度检测检测），并减少了DNA复制（如EdU合成检测法所示）（图3c）。沉默USP10还通过肿瘤圈形成和体外限制稀释测定法，损害了GSC自我更新（图3d–g）。为了验证USP10的去泛素酶活性是否对GSC功能必要，作者考察了野生型（WT）或催化不活性突变体（C424A， CA）的异位表达是否能挽救USP10破坏带来的影响。作者采用了另一种USP10 shRNA，专门靶向内源性USP10 mRNA（指定为shUSP10-3'）的3' UTR，以实现USP10表达的敲低。因此，作者能够同时沉默内源性USP10并过度表达GSCs中的外源性USP10。这些结果表明USP10通过其去泛素酶活性调控SATB2蛋白水平和GSC功能。

   为研究USP10对GSC驱动肿瘤生长的体内影响，将表达shNT或shUSP10的GSCs颅内注射至免疫缺陷小鼠的大脑。携带由GSCs衍生的外种移植并表达shUSP10的动物，其生存时间延长且肿瘤体积减少，均优于对照组（图3h，i）。对Ki67和SOX2的免疫荧光染色还表明，破坏USP10显著抑制了GBM异种移植中的细胞增殖并减少GSC数量（图3j–m）。这一发现表明，USP10破坏促进GBM异种移植中GSCs的分化。综合来看，作者的数据表明USP10在促进GSC自我更新和GSC驱动的肿瘤生长中发挥关键作用。

图3：USP10的中断会损害GSC自我更新和GSC驱动的肿瘤生长。

4、DTX3L会损害GSC自我更新和GBM肿瘤生长

   由于GSC中DTX3L的表达远低于USP10，作者通过过表达DTX3L来考察DTX3L在GSCs中的作用。作者发现DTX3L的过度表达降低了SATB2蛋白水平，但这种过度表达对SATB2 mRNA水平没有影响（图4a， b）。基于这些发现，作者假设DTX3L也可能影响GSC功能。作者的结果显示，DTX3L的过度表达显著抑制了GSC的生长并减少了DNA复制（图4c–e）。肿瘤球形成和体外限制稀释测定显示，DTX3L的过度表达会损害GSC自我更新（图4f–i）。作者还考察了缺乏E3泛素连接酶活性的DTX3L突变体（C561S和C564S，2CS）是否能调控SATB2蛋白水平和GSC功能。随后作者调查了DTX3L的过度表达是否影响了小鼠大脑中GSC驱动的肿瘤生长。结果显示，携带由DTX3L过度表达GSC产生的肿瘤的小鼠，生存时间延长且肿瘤质量减少（图4j， k）。此外，由DTX3L过度表达的GSC衍生的肿瘤中，增殖细胞和GSC群体数量远少于对照肿瘤（图4l–o）。综合来看，作者得出DTX3L对GSC自我更新和GBM生长具有抑制作用。

图4：DTX3L的过度表达损害GSC自我更新及GSC驱动的肿瘤生长。

5、DTX3L泛素化SATB2，而USP10介导SATB2去泛素化

   作者的结果表明，E3泛素连接酶DTX3L降低了SATB2的蛋白质水平，而去泛素酶USP10负责保持SATB2蛋白水平。为研究DTX3L或USP10对SATB2蛋白稳定性的影响，对DTX3L过表达或USP10沉默GSCs进行了CHX处理。IB分析显示，DTX3L的过度表达或USP10的破坏导致SATB2蛋白的不稳定（图5a-d）。鉴于SATB2通过泛素-蛋白酶体途径降解，作者试图验证DTX3L和USP10通过泛素-蛋白酶体途径调控SATB2的更新。结果显示，MG-132处理抑制了由DTX3L过表达或USP10破坏引起的SATB2蛋白水平下降（图5e，f）。这些数据表明，DTX3L和USP10以蛋白酶体依赖的方式调控SATB2的稳定性。为了确定DTX3L是否确实催化SATB2的多泛素化，作者在HEK293T细胞中共表达了SATB2-Myc和DTX3L-Flag以及His泛素。如图所示。5g，DTX3L的过度表达促进了HEK293T细胞中SATB2的泛素化。一贯地，DTX3L的过度表达促进了GSCs中SATB2的泛素化（图5h）。随后，作者在HEK293T细胞中共同表达了SATB2-Myc和USP10-Flag以及His-泛素。结果表明，USP10的过度表达降低了HEK293T细胞中SATB2的泛素化（图5i）。此外，USP10的破坏增强了GSCs中SATB2的泛素化（图5j）。泛素上的七种不同的Lys残基可实现多泛素化。因此，作者生成了具有完整K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63连接的泛素载体，以研究SATB2蛋白上哪种类型的连接被DTX3L或USP10调控。DTX3L强劲地刺激了K48连接多泛素化的组装，而对其他泛素连接类型则无影响（图5k、l）。进一步分析显示，USP10特异性地分解了K48连接的多泛素化，而未影响其他多泛素链类型（图5m，n）。这些结果表明，DTX3L促进SATB2的K48联多泛素化，而USP10则阻止这种多泛素型SATB2。

图5：DTX3L介导SATB2泛素化，而USP10通过去泛素稳定SATB2蛋白。

6、SATB2的过度表达可以挽救USP10破坏或DTX3L过表达所带来的影响

   鉴于USP10的破坏或DTX3L的过度表达降低了SATB2蛋白水平，作者接着探讨了外源性SATB2的过度表达是否能挽救USP10破坏或DTX3L过度表达引起的效应。通过引入额外的SATB2，通过引入额外的SATB2，将USP10破坏或DTX3L过表达引起的SATB2水平降低，以匹配对照组内源性SATB2水平（图6a、b）。SATB2的外源性过度表达挽救了由USP10破坏或DTX3L过表达引起的GSC增殖和自我更新受损（图6c-h）。重要的是，SATB2的过度表达大大减弱了携带由USP10沉默或DTX3L过度表达GSC衍生异种移植小鼠的生存率提升（图6i、j）。一贯地，SATB2的过度表达能够恢复由USP10破坏或DTX3L过表达受损的GSC驱动肿瘤生长（图6k，l）。此外，免疫荧光染色证实，SATB2的过度表达恢复了因USP10破坏或DTX3L过度表达而受损的体内细胞增殖，并挽救了由USP10破坏或DTX3L过度表达导致的GSC群体减少（图6m–p）。综合来看，这些数据表明，SATB2的过度表达能够挽救USP10破坏或DTX3L过表达引起的影响，表明USP10和DTX3L通过调控SATB2蛋白水平，调节GSC自我更新和GSC驱动的肿瘤生长。

图6：异位表达SATB2挽救了USP10破坏或DTX3L过表达引起的效应。

7、USP10和DTX3L共同调控K266处SATB2的泛素化

   为了精确定位人类SATB2蛋白中受USP10或DTX3L调控的赖氨酸残基，作者生成了一系列截断的SATB2突变体并将其导入HEK293T细胞。值得注意的是，在各种突变体中，只有包含氨基酸232至437的SATB2突变体表达对USP10过表达的反应显著增加（图7a）。此外，DTX3L的过度表达还抑制了该SATB2突变体（氨基酸232–437）的表达，但未影响其他突变体的表达（图7b）。随后，作者将SATB2突变体（氨基酸232–437）中的所有赖氨酸残基单独突变为精氨酸。结果显示，SATB2-K266R突变体独特地未受USP10或DTX3L的过度表达影响（图7c，d）。蛋白质序列比对分析显示，SATB2蛋白中含有K266的结构域在七个不同物种中高度保守（图7e）。为确认SATB2的泛素位点，作者进行了质谱分析共表达SATB2-Myc和His-泛素的HEK293T细胞中免疫沉淀的SATB2蛋白。结果显示，泛素基层仅在K266残基上被检测到（图7f），确认K266位点是SATB2的泛素化位点。为了确定 GSCs 中 SATB2 的 K266 是否受 USP10 或 DTX3L 调控，作者在全长 SATB2 中突变了 K266，并将该突变体引入 GSCs。结果证实，GSCs中SATB2-K266R突变体的表达未受USP10破坏或DTX3L过表达影响（图7g–j）。此外，为验证DTX3L是否能直接催化K266残基上的SATB2泛素化，作者在HEK293T细胞中与DTX3L-Flag和His-泛素共表达Myc标记的WT SATB2或K266R（KR）突变SATB2。CoIP实验表明，DTX3L的过度表达促进了SATB2泛素化，而对SATB2-K266R突变体的泛素化则无明显影响（图7k）。此外，USP10的过度表达减少了SATB2泛素化，且对SATB2-K266R突变体的泛素化无影响（图7l）。这些数据共同表明，SATB2中的K266对USP10和DTX3L的去泛素化和泛素化至关重要。

图7：USP10/DTX3L调控K266处SATB2的泛素化。

8、USP10抑制剂Wu-5抑制GSC自我更新及GSC驱动的肿瘤生长

   为评估USP10在GBM中的治疗潜力，作者研究了一种名为Wu-5的小分子抑制剂对USP10的药物抑制是否会影响GSCs及GSC驱动的肿瘤生长。细胞存活能力测定显示，8μ米和16μ米的Wu-5剂量依赖性抑制GSC生长，而较低浓度（2和4μ米）则无显著效果（图8a）。Wu-5治疗还以剂量依赖性方式下调GSC自我更新并下调SOX2表达（图8b–e ）。此外，Wu-5（8和16μM）剂量依赖性诱导的GSC凋亡，这一点通过凋亡标志物Cripd Caspase-7和Cripd PARP的升高水平得以证明（补充图）。如预期，Wu-5处理以剂量和时间依赖性方式降低了SATB2蛋白水平（图8f）。作者还观察到Wu-5处理以剂量和时间依赖性的方式降低了USP10蛋白水平（图8f），这与以往研究的结果一致 37,38.然而，8μ米和16μ米Wu-5治疗对SATB2和USP10 mRNA水平无影响（图8g）。Wu-5在8和16微M剂量依赖性下，一致地提高了GSCs中SATB2的泛素化（图h）。为确定SATB2过表达是否能挽救Wu-5处理对GSC维持的影响，作者用SATB2-Myc转导GSCs，并用Wu-5（16μM）处理。数据表明，Wu-5处理通过USP10-SATB2轴抑制GSC维持。随后，作者评估了Wu-5对携带GSC衍生异种移植小鼠的治疗效果。与作者的体外研究结果一致，Wu-5治疗有效延长了携带GSC衍生肿瘤的小鼠的存活时间，并减少了小鼠大脑中的肿瘤体积（图8i–k）。Wu-5 施用还显著减少了肿瘤中 Ki67 阳性增殖细胞和 SOX2 阳性 GSC 群体（图8l–0）。为确认Wu-5是否能穿透血脑屏障，作者对BALB/c裸小鼠腹腔内注射Wu-5或DMSO，随后通过LC-MS/MS在小鼠脑组织中检测到Wu-5。结果表明，接受Wu-5治疗2小时的小鼠大脑组织中Wu-5浓度平均达到673 ng/g，而DMSO处理对照组的大脑中Wu-5水平极低，几乎检测不到。这些数据综合表明，药理学抑制USP10通过促进SATB2不稳定显著抑制GSC自我更新和肿瘤生长，表明靶向USP10可能有效改善GBM治疗。

图8：Wu-5治疗抑制GSC自我更新及GSC驱动的肿瘤生长。

结论：

    该研究发现去泛素酶USP10与E3泛素连接酶DTX3L协同作用，调控SATB2的泛素化和稳定性，从而调控GSC的维持和肿瘤生长。通过药理抑制USP10来靶向SATB2的稳定性，有望成为提升GBM治疗疗效的有前景的策略。

参考文献：

Guo M, Luo W, Ling P, Lei H, Li L, Duan C, et al. USP10 promotes glioma stem cell maintenance and glioblastoma growth by antagonizing DTX3L-mediated SATB2 ubiquitination. Nat Commun. 2026 Jan 8;17(1):164. doi: 10.1038/s41467-025-67418-9. PMID: 41507172.