糖酵解–线粒体代谢失衡驱动 HNF-1β 阳性透明细胞癌的 ROS 依赖性细胞死亡

   卵巢透明细胞癌以HNF-1ß过表达为特征，并且已知对化疗具有耐药性。特异性靶向HNF-1ß的抑制剂筛选使我们确定了actionin作为癌症治疗的候选药物。我们证实GSK-3ß干扰/抑制，作为HNF-1ß途径的一个组成部分，与actionin联合，与单一治疗相比具有非常有效的抗肿瘤作用。在表达HNF-1ß的肾透明细胞癌中也观察到同样的效果。actionin通过抑制有氧呼吸促进线粒体的产生，从而降低AMPK水平并增加ROS的产生。然而，它也升高GADD45α的表达并诱导线粒体自噬。GSK-3ß抑制抑制糖酵解并将能量生成转移到OXPHOS，导致ROS生成增加。此外，这种组合产生了超过代谢能力的过量ROS，这些ROS积聚在脂质双分子层中，导致CHOP基因表达进一步增加，线粒体周转受到抑制。GSK-3ß抑制剂和actionin联合在体内表现出强大的肿瘤抑制作用，且没有严重的副作用。GSK-3ß抑制剂联合actionin可通过抑制糖酵解和促进线粒体更新，有效消除HNF-1ß过表达的癌细胞，为癌症治疗提供新的选择。本文于2025年12月发表于Cell Death and Disease（IF=9.6）上。

技术路线：

结果：

1）筛选在CCC中具有HNF-1ß过表达的合成致死效应的候选抑制剂

   使用两种CCC细胞系：TOV-21G，过表达HNF-1ß，和ES2，阴性表达HNF-1ß。图1A显示了两者的蛋白表达。方法概要如图1B所示。在46种抑制TOV-21G增殖的抑制剂中，我们选择了actionin作为氨基肽酶M抑制剂。细胞增殖实验显示，GSK-3ß干扰联合actionin可阻止细胞增殖并引起细胞增殖能力下降，且无剂量依赖性，所有浓度均显著降低（图1C）。图1D显示了细胞影响。双染色显示有显著差异，表明actionin诱导细胞死亡。GSK-3ß抑制剂AR-A014418和SB216763显示出抗肿瘤作用，处理的细胞达到生长平台（图1E）。当与AR-A014418或SB216763联合使用时，长时间使用actionin完全阻止了增殖（图1F）。为了评估对另一种癌细胞系的影响，用actionin（20 μM）和AR-A014418（27 μM）处理786-O肾透明细胞癌（HNF-1ß阳性），导致细胞下降和完全破坏（图1G）。因此，actionin或GSK-3ß抑制剂的联合减少细胞增殖。

2）干扰GSK-3ß影响细胞周期和凋亡

   与DMSO组相比，actionin显著增加了亚G1期比例。与DMSO组相比，actionin也显著降低了G1期比例，si-GSK-3ß+actionin与si-control+actionin相比降低了G1期比例（图2A）。提示si-GSK-3ß+actionin诱导细胞强烈凋亡。我们使用连续成像技术对caspase 3/7和Annexin V进行了细胞凋亡实验，si-GSK-3ß+actionin显著提高了caspase 3/7水平。在Annexin V检测中，actionin增加了Annexin V水平。与细胞周期实验类似，在actionin存在下，si-GSK-3ß比对照显示出更高的Annexin V水平（图2B）。我们选择AR-A014418作为GSK-3ß抑制剂，评估其与actionin对细胞周期的影响。结果与先前的研究结果一致，但AR-A014418单独抑制G1期（图2C）。与短干扰研究相比，actionin暴露下caspase 3/7阳性细胞比例显著下降。在Annexin V试验中，与短干扰研究类似，actionin增加了Annexin V水平（图2D）。

3）GSK-3ß干扰和actionin对线粒体动力学的影响

   actionin和GSK-3ß干扰24 h后，线粒体强度较对照组增加。36和48 h时，在actionin作用下线粒体强度水平升高。然而，在GSK-3ß干扰下，它们没有进一步增加（图3A）。为了了解ROS动力学，我们测量了羟基自由基和超氧化物。在24和48小时，羟基自由基增加。同样，与对照组相比，actionin单一治疗和actionin与GSK-3ß干扰联合治疗组超氧化物水平升高(图3B)。与对照组相比，actionin单药治疗和actionin与GSK-3ß干扰联合治疗时氧化MitoPeDPP增加（图3B）。为了了解抗氧化动力学，我们测量了谷胱甘肽的浓度。GSK-3ß干扰使GSH升高，而联合治疗无显著变化。与对照组相比，GSK-3ß干扰加DMSO或actionin组的氧化形式GSSG更高（图3C）。与对照组相比，actionin单药治疗和actionin联合GSK-3ß干扰治疗的线粒体自噬增加。DAL绿是一种小荧光分子，可以检测自噬体和自溶体。然后自噬水平进一步升高（图3D）。我们证实，这些ROS清除剂，如MitoTEMPO，可以逆转药物联合诱导的caspase-3/7活化和Annexin V阳性（图3E）。GSK-3ß干扰或actionin刺激ROS代谢。虽然Actinonin可以独立代谢ROS，但与GSK-3ß干扰联合，导致ROS代谢增加，超过耐受水平，导致ROS在脂质双分子层积聚，阻碍线粒体再生。

4）GSK-3ß干扰与actionin影响能量动力学和线粒体应激

   与对照组相比，Actinonin作用48 h后c-Myc mRNA的表达显著降低。与单独actionin相比，GSK-3ß干扰和actionin显著降低了PGC-1α的表达。actionin组AMPK水平在24 h时下降， 48 h时，与actionin对照组相比，si-control组AMPK水平较低，si-GSK-3ß组AMPK水平较高。与对照组相比，actionin和GSK-3ß干扰在24和48 h时CHOP表达均升高。actionin也增加了GADD45 α的表达（图4A）。m-TOR表达差异无统计学意义，但联合用药组48 h磷酸化水平较高。同样，AMPK也没有显著差异，但随着Actinonin的加入，磷酸化程度有所增加。50 μM剂量的actionin在36 h增加了PINK1的表达，在48 h，si-GSK-3ß和actionin联合使用比si-control+actionin或DMSO的PINK1表达量高。PINK1激活Parkin，使线粒体外膜蛋白泛素化，促进自噬。然而，si-GSK-3ß和si-control中的actionin在36和48 h导致Parkin表达降低。与单独actionin或DMSO相比，GSK-3ß干扰在36小时时降低了phospho-Parkin比值。对线粒体蛋白运输至关重要的TOM20在24 h时升高，在36 h时降低，si-GSK-3ß或si-control + actionin在24 h时显著高于对照组。在36小时，观察到显著下降。参与mtDNA转录和复制的转录因子TFAM在36 h时被actionin上调。此外，在48小时，si-GSK-3ß + actionin显著提高TFAM水平。Parkin和TOM20表现出与常规Western blot相似的行为（图4B）。这些结果表明，actionin触发细胞内能量消耗，导致内质网应激升高和DNA损伤。si- GSK-3ß和actionin的联合可导致明显的线粒体损伤。

5）GSK-3ß干扰和actionin联合作用影响有氧呼吸和糖酵解，导致异种移植小鼠模型中肿瘤生长降低

   与DMSO组和si-GSK-3ß相比，actionin显著降低了基础呼吸（图5A)。它还降低了OCR和ECAR的变化。应用Rotenone/antimycin A后，actionin作用下si-control和si-GSK-3ß组的ECAR水平差异显著（图5A)。在体内试验中，与对照组相比，GSK-3ß抑制剂联合actionin可显著降低肿瘤总重量。两组间体重减轻程度相似，肝肾功能无显著差异。检测Ki-67表达以评估细胞增殖。与对照组相比，GSK-3ß抑制剂联合actionin显著降低Ki-67指数（图5 B)。

结论：

   GSK-3ß抑制剂联合actionin治疗加速ROS积累，减少糖酵解，导致透明细胞癌细胞凋亡。

参考文献：

Kawahara N, Kuniyasu H, Mori S, Kishi S, Sugimoto S, Maehana T, Yamanaka S, Kawaguchi R, Kimura F. Inhibition of glycolysis and stimulation of mitochondrial biogenesis lead to increased ROS levels and cell death in HNF-1ß positive clear cell carcinoma. Cell Death Dis. 2025 Dec 1;16(1):879. doi: 10.1038/s41419-025-08243-2.