癌症来源的岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过PTEN/AKT/mTOR/IRF1/CXCL10轴促进ESCC血管生成和转移

   肿瘤来源的岩藻糖基化外泌体（FUC-Exo）在癌症进展中发挥重要作用。然而，岩藻糖基化外泌体来源的微小RNA（miRNA）在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的功能及机制仍知之甚少。本研究通过小扁豆凝集素（LCA）包被的磁珠分离岩藻糖基化外泌体，结合小RNA测序和RT-qPCR，鉴定出miR-6842-3p是一种新型ESCC生物标志物。结果显示，miR-6842-3p在ESCC组织和血清岩藻糖基化外泌体中表达上调，与临床晚期阶段、较差预后显著相关，可作为ESCC的早期诊断生物标志物。miR-6842-3p具有致癌基因功能，能促进ESCC的肿瘤生长、转移和血管生成。肿瘤来源的岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p被HUVECs内化后，会下调PTEN表达，触发AKT和mTOR的磷酸化，进而抑制IRF1表达，最终下调CXCL10表达并驱动血管生成。这些发现表明，miR-6842-3p是ESCC生长、转移和血管生成的关键驱动因子，岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过介导PTEN/AKT/mTOR/IRF1/CXCL10轴促进血管生成，凸显其作为ESCC新型生物标志物和治疗靶点的潜力。这篇文章于2025年11月发表于《Oncogene》期刊上，IF:7.3。

研究技术路线：

主要实验结果：

1、岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p在食管鳞状细胞癌中上调并作为新型生物标志物

   为阐明岩藻糖基化外泌体来源的微小RNA（miRNA）在细胞间通讯及食管鳞状细胞癌（ESCC）进展中的作用，作者建立了包含生物标志物发现、筛选、训练、内部验证和外部验证五个阶段的综合方法学框架（图1A）。通过这一严格流程，作者鉴定出四种在ESCC患者血清岩藻糖基化外泌体中差异上调的miRNA（miR-1228-5p、miR-6842-3p、miR-30e-3p和miR-642a-3p），但它们在总外泌体中的表达无显著差异。由于miR-1228-5p、miR-30e-3p和miR-642a-3p在多种恶性肿瘤中已得到广泛研究，而miR-6842-3p的功能作用尚未明确，因此本研究聚焦其在ESCC中的作用。经系统研究和逐步验证，结果表明岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p是一种具有潜力的ESCC诊断生物标志物（筛选队列：曲线下面积（AUC）=0.888；训练队列：AUC=0.916；内部验证队列：AUC=0.870；外部验证队列：AUC=0.862），其诊断效能显著优于传统血清生物标志物鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和癌胚抗原（CEA）（图1B）。尤为重要的是，数据显示早期ESCC患者岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p表达水平较健康对照显著升高（图1C、D）。这一独特的表达模式凸显其作为ESCC早期检测可靠指标的潜力（训练队列：AUC=0.908；外部验证队列：AUC=0.875），相较于传统CEA标志物，在早期疾病识别中展现出明显更优的诊断性能（图1E）。此外，分析结果显示，血清岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p水平升高与临床晚期阶段显著相关（训练队列：p=0.019，表1；外部验证队列：p=0.037），且与患者较差预后相关（训练队列：p<0.01；风险比（HR）=2.165）（表1，图1F）。同时，与血清表达谱一致，癌组织中miR-6842-3p水平较癌旁正常组织（n=40）显著升高（图1G）。这些综合发现表明，血清岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p可能是ESCC早期诊断和预后评估的有价值生物标志物，且可能在ESCC进展中发挥重要作用，值得进一步探究其功能机制。

图1. 岩藻糖基化外泌体 miR-6842-3p 在食管鳞状细胞癌中的诊断和预后价值

2、miR-6842-3p在体外和体内促进食管鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭

   由于miR-6842-3p在KYSE150细胞中表达较低，在TE-1细胞中表达较高，为进一步阐明miR-6842-3p在ESCC发生发展中的致癌机制，作者分别在KYSE150细胞中转染miR-6842-3p模拟物（mimics），在TE-1细胞中转染miR-6842-3p抑制剂（inhibitor），进行功能获得性和功能缺失性实验。RT-qPCR验证结果显示转染成功。EDU实验、CCK-8实验和集落形成实验结果表明，过表达miR-6842-3p显著增强KYSE150细胞增殖能力，而抑制miR-6842-3p表达则显著减弱TE-1细胞增殖能力（图2A-C）。此外，过表达miR-6842-3p显著提高KYSE150细胞的迁移和侵袭能力，而抑制miR-6842-3p则降低TE-1细胞的这些能力（图2D、E）。作者还检测了增殖相关标志物（PCNA和Cyclin D1）和上皮-间质转化（EMT）相关标志物（N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和Snail1）。Western blot结果显示，过表达miR-6842-3p可上调ESCC细胞中间质标志物（N-钙粘蛋白和Snail1）和增殖标志物（PCNA和Cyclin D1）的表达，下调上皮标志物（E-钙粘蛋白）的表达，反之亦然（图2F）。这些结果表明，miR-6842-3p通过促进增殖、迁移、侵袭和EMT过程推动ESCC进展。

图2.miR-6842-3p在体外和体内促进食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化

   为验证体外实验结果，作者进行了体内实验。构建稳定转染Lv-miR-6842-3p模拟物（miR-OE）的KYSE150细胞和转染Lv-miR-6842-3p抑制剂（miR-KD）的TE-1细胞，RT-qPCR验证转染效率（。在异种移植模型中，与miR-OE阴性对照（NC）组相比，miR-OE组肿瘤体积和重量显著增大；而与对照组相比，miR-KD组肿瘤体积和重量显著减小（图2G-I）。免疫组织化学（IHC）分析显示，miR-OE组肿瘤组织中Ki-67表达升高，而miR-KD组肿瘤组织中Ki-67表达降低，证实miR-6842-3p具有促肿瘤生长作用（图2J）。在肺转移模型中，过表达miR-6842-3p加速转移进程（肺转移灶增多），而抑制其表达则抑制转移扩散（图2K、L）。综上，这些结果表明miR-6842-3p促进ESCC生长和转移，在ESCC进展中发挥关键作用。

3、miR-6842-3p靶向抑制PTEN表达，激活AKT信号通路，促进食管鳞状细胞癌增殖和转移

   为进一步阐明miR-6842-3p调控ESCC进展的机制，作者利用五个mRNA靶标预测数据库（miR TarBase、miRWalk、miRDB、RNA22和RNAInter）筛选miR-6842-3p的潜在下游靶基因。分析鉴定出13个候选靶基因（图3A），其中7个为已知的肿瘤抑制基因。RT-qPCR结果显示，在过表达miR-6842-3p的KYSE150细胞中，这7个肿瘤抑制基因均显著下调，其中PTEN的抑制作用最为显著（图3B）。PTEN作为一种公认的肿瘤抑制基因，在多种癌症中发挥关键作用。

图3.miR-6842-3p靶向抑制 PTEN 表达，激活 AKT 信号通路，促进食管鳞状细胞癌增殖和转移

   为证实PTEN是miR-6842-3p的直接靶基因，作者在HEK293T细胞中进行双荧光素酶报告基因实验。结果显示，miR-6842-3p显著降低野生型PTEN 3'非翻译区（3'UTR）的荧光素酶活性，但对突变型PTEN 3'UTR的荧光素酶活性影响极小（图3C、D）。RT-qPCR和Western blot进一步验证显示，过表达miR-6842-3p显著降低KYSE150细胞中PTEN的表达，而敲低miR-6842-3p则升高TE-1细胞中PTEN的表达（图3E）。

   AKT通路位于PTEN下游，已有研究表明在人类癌症中PTEN失活常导致AKT激活。Western blot结果显示，过表达miR-6842-3p可下调KYSE150细胞中PTEN表达，上调磷酸化AKT（p-AKT）水平；相反，敲低miR-6842-3p显著升高TE-1细胞中PTEN表达，降低p-AKT水平（图3E、F）。

   为明确miR-6842-3p是否通过靶向PTEN激活AKT信号通路，作者进行了挽救实验。Western blot结果显示，过表达PTEN可逆转miR-6842-3p模拟物介导的p-AKT、EMT相关标志物（N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和Snail1）以及增殖相关标志物（PCNA和Cyclin D1）表达的改变（图3G）。一致地，CCK-8实验显示，过表达PTEN可消除miR-6842-3p对KYSE150细胞的促增殖作用（图3H）。Transwell实验表明，在miR-6842-3p模拟物+PTEN共表达组中，miR-6842-3p模拟物增强的KYSE150细胞迁移和侵袭能力显著减弱（图3I）。综上，这些结果表明miR-6842-3p靶向抑制PTEN表达，激活AKT信号通路，进而促进ESCC增殖和转移。

4、食管鳞状细胞癌细胞将miR-6842-3p富集到岩藻糖基化外泌体中，内皮细胞通过内化肿瘤来源的岩藻糖基化外泌体实现miR-6842-3p的传递

   鉴于血管生成在癌症转移中的关键作用，以及越来越多的证据表明外泌体miRNA与多种癌症的转移过程相关，作者进一步探究miR-6842-3p是否通过岩藻糖基化外泌体介导的传递在肿瘤血管生成中发挥作用。首先，RT-qPCR检测不同ESCC细胞中miR-6842-3p水平，结果显示与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）相比，miR-6842-3p在ESCC细胞（包括KYSE150、KYSE140和TE-1细胞）中高表达。选择miR-6842-3p表达相对较高的KYSE150和TE-1细胞进行后续实验。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和Western blot鉴定从这些细胞条件培养基（CM）中分离的岩藻糖基化外泌体（图4A、B）。为探究ESCC细胞如何在分子水平调控HUVECs，作者首先构建miR-6842-3p稳定过表达的KYSE150和TE-1细胞系。RT-qPCR结果显示，ESCC细胞中过表达miR-6842-3p可导致细胞内及癌细胞来源的岩藻糖基化外泌体中miR-6842-3p水平均升高（图4C、D），表明ESCC细胞将miR-6842-3p富集到肿瘤来源的岩藻糖基化外泌体中。此外，用来自过表达miR-6842-3p的ESCC细胞的岩藻糖基化外泌体处理HUVECs后，HUVECs中miR-6842-3p水平呈时间依赖性升高，提示HUVECs通过内化岩藻糖基化外泌体实现miR-6842-3p的传递（图4E）。外泌体摄取实验进一步证实ESCC细胞来源的岩藻糖基化外泌体可被HUVECs内化，在转染FAM标记的miR-6842-3p过表达载体的KYSE150或TE-1细胞来源的、经WisTracker标记的岩藻糖基化外泌体中，HUVECs内可观察到荧光信号（图4F）。这些结果表明，miR-6842-3p被ESCC细胞包装进岩藻糖基化外泌体，并通过岩藻糖基化外泌体途径传递至HUVECs。

图4.miR-6842-3p通过肿瘤来源的岩藻糖基化外泌体传递至人脐静脉内皮细胞

5、食管鳞状细胞癌细胞通过富含miR-6842-3p的岩藻糖基化外泌体促进肿瘤血管生成和进展

   为进一步探究岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p在促进肿瘤血管生成中的作用，作者首先向HUVECs瞬时转染miR-6842-3p模拟物或抑制剂以调控其表达，并通过RT-qPCR验证转染效果。管腔形成实验明确显示，miR-6842-3p模拟物增强HUVECs的毛细血管样管腔形成能力，而miR-6842-3p抑制剂则抑制这些细胞的管样结构形成。此外，瞬时转染miR-6842-3p模拟物可上调HUVECs中增殖和血管生成标志物（MMP2、CD31、PCNA和Cyclin D1）的蛋白表达，同时下调紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1和Claudin5）的表达，反之亦然。为进一步验证这一观点，作者构建稳定过表达或敲低miR-6842-3p的HUVECs，并通过RT-qPCR检测miR-6842-3p表达。随后进行体内Matrigel栓血管生成实验，将Matrigel皮下注射到小鼠体内。结果显示，过表达miR-6842-3p显著促进Matrigel栓内的新生血管形成；相反，敲低miR-6842-3p则减少迁移至Matrigel栓内的血管数量。作者还检测了异种移植模型肿瘤组织中血管标志物CD31的表达。IHC分析显示，与相应对照组相比，miR过表达（miR-OE）组肿瘤组织中CD31表达显著上调，miR敲低（miR-KD）组肿瘤组织中CD31表达显著下调。这些结果表明，miR-6842-3p水平升高可促进血管生成。

   为明确miR-6842-3p是否通过岩藻糖基化外泌体（FUC-Exo）传递发挥其促血管生成作用，作者用外泌体释放抑制剂GW4869预处理KYSE150（miR-OE）细胞。随后从三组细胞中分离岩藻糖基化外泌体：（miR-OE NC）岩藻糖基化外泌体、（miR-OE）岩藻糖基化外泌体和（miR-OE + GW4869）岩藻糖基化外泌体，并用这些外泌体处理HUVECs 24小时。RT-qPCR结果显示，用（miR-OE）岩藻糖基化外泌体处理后，HUVECs中miR-6842-3p水平显著升高，而用（miR-OE + GW4869）岩藻糖基化外泌体预处理后，这种上调作用被消除。这些结果还表明，ESCC细胞通过岩藻糖基化外泌体将miR-6842-3p传递至内皮细胞，导致受体HUVECs中miR-6842-3p富集（图5A）。功能实验（EDU、迁移、伤口愈合实验）显示，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体处理显著增强HUVECs增殖和迁移能力，而（miR-OE + GW4869）岩藻糖基化外泌体预处理则显著减弱这些作用（图5B-D）。免疫荧光实验显示，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体损害HUVECs中紧密连接蛋白的表达，而GW4869可逆转这一效应（图5E）。此外，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体显著促进体外血管生成，而（miR-OE + GW4869）岩藻糖基化外泌体预处理则阻断这一过程（图5F）。这些结果表明，ESCC细胞通过岩藻糖基化外泌体诱导内皮细胞中miR-6842-3p上调，进而增强血管通透性并促进血管生成。

图5.岩藻糖基化外泌体 miR-6842-3p 促进人脐静脉内皮细胞生长、血管生成及食管鳞状细胞癌进展

   为验证岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p的体内作用，作者建立了肿瘤异种移植和肺转移模型。在异种移植模型中，对携带KYSE150细胞来源肿瘤的小鼠每隔一天给予指定的岩藻糖基化外泌体（5μg）处理（图5G）。对肿瘤大小/体积的评估，以及增殖标志物Ki-67和CD31阳性血管形成的免疫组织化学分析表明，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体促进ESCC生长和血管生成。值得注意的是，GW4869有效消除了（miR-OE）岩藻糖基化外泌体的这些促生长和促血管生成作用（图5H、I），表明岩藻糖基化外泌体通过递送miR-6842-3p促进ESCC致癌作用和血管生成。为评估岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p对ESCC转移的影响，作者通过尾静脉向BALB/c裸鼠注射2×10^6个KYSE150-luc细胞建立肺转移模型。注射后8天，小鼠每隔一天接受（miR-OE NC）岩藻糖基化外泌体、（miR-OE）岩藻糖基化外泌体或（miR-OE + GW4869）岩藻糖基化外泌体（5μg）处理。两个月后，处死小鼠并分析肺组织（图5J）。转移灶定量结果显示，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体促进ESCC转移，而GW4869有效抵消这种促转移作用（图5K）。综上，这些结果表明，岩藻糖基化外泌体介导miR-6842-3p从ESCC细胞向受体细胞的传递，从而促进肿瘤生长、血管生成和转移。

6、岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p通过下调PTEN促进食管鳞状细胞癌进展和血管生成

   为探究岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p是否也通过调控内皮细胞中的PTEN对血管生成产生类似影响，作者首先通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-6842-3p与PTEN在HUVECs中的直接调控关系，然后从KYSE150（miR-OE）细胞和TE-1（miR-KD）细胞的条件培养基中纯化岩藻糖基化外泌体。与作者的假设一致，岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p可调节HUVECs中PTEN mRNA的表达（。此外，过表达PTEN可减弱岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p介导的HUVECs中PTEN mRNA、增殖标志物（PCNA和Cyclin D1）、血管生成标志物（MMP2和CD31）以及紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1和Claudin5）表达的改变（图6A、E、F）。与图5中的数据一致，过表达PTEN也可消除岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p增强的HUVECs增殖、迁移和管腔形成能力（图6B-D）。这些结果表明，岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p通过沉默HUVECs中的PTEN促进血管生成。

图6.岩藻糖基化外泌体来源的 miR-6842-3p 通过下调 PTEN 促进食管鳞状细胞癌进展和血管生成

   作者还利用异种移植模型、肺转移模型和体内Matrigel栓血管生成实验验证岩藻糖基化外泌体来源的miR-6842-3p对癌症进展的影响（图6G-M）。如图6H-K所示，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体显著促进ESCC生长、转移和血管生成，而过表达PTEN可挽救这些作用。一致地，IHC分析显示，异种移植模型中（miR-OE）岩藻糖基化外泌体组肿瘤组织中Ki-67和CD31表达显著升高（图6K）。然而，过表达PTEN可消除（miR-OE）岩藻糖基化外泌体介导的异种移植肿瘤组织中Ki-67和CD31的诱导表达（图6K）。在Matrigel栓血管生成实验中，与体外实验结果一致，miR-OE组Matrigel栓内血管结构更丰富。然而，过表达PTEN可消除miR-OE诱导的Matrigel栓内新生血管形成。综上，这些结果表明，ESCC细胞分泌的岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过在体内靶向PTEN促进血管生成和ESCC进展。

7、岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过激活AKT/mTOR信号通路促进食管鳞状细胞癌血管生成

   PTEN作为一种公认的肿瘤抑制基因，调控多种细胞功能，包括细胞增殖和分化。在PTEN调控的信号级联反应中，AKT/mTOR通路是关键靶点，PTEN主要通过其内在的磷酸酶功能对其产生影响。为阐明肿瘤来源的岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p促进ESCC进展和血管生成的分子机制，作者进行了转录组测序分析。转录组测序和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，miR-6842-3p过表达下调的基因显著富集于8个关键通路，包括PI3K/AKT通路和趋化因子信号通路——基于这两个通路在促进肿瘤进展和血管生成中的关键作用，作者将其列为进一步研究的重点（图7A）。为进一步验证岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p对PTEN/AKT/mTOR通路的调控作用，作者从稳定过表达或敲低miR-6842-3p的ESCC细胞系（KYSE150和TE-1）中分离岩藻糖基化外泌体，然后用这些外泌体处理HUVECs。Western blot结果显示，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体下调HUVECs中PTEN蛋白水平，同时上调p-AKT和p-mTOR水平；相反，（miR-KD）岩藻糖基化外泌体处理显著降低p-AKT和p-mTOR水平，升高PTEN表达（图7B）。为明确（miR-OE）岩藻糖基化外泌体是否通过靶向PTEN激活AKT/mTOR信号通路，作者进行了挽救实验。结果显示，过表达PTEN可部分逆转（miR-OE）岩藻糖基化外泌体对HUVECs中p-AKT和p-mTOR表达的影响（图7C）。值得注意的是，AKT抑制剂伊帕替尼（Ipatasertib）可逆转（miR-OE）岩藻糖基化外泌体诱导的HUVECs中p-mTOR上调（图7D）。功能实验进一步证实，伊帕替尼或雷帕霉素（Rapamycin）处理可消除（miR-OE）岩藻糖基化外泌体对HUVECs的促增殖、促迁移和促血管生成作用（图7E-J）。综上，这些结果表明，岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过下调PTEN表达并激活AKT/mTOR信号通路促进ESCC血管生成。

图7.岩藻糖基化外泌体 miR-6842-3p 通过激活 AKT/mTOR 信号通路促进食管鳞状细胞癌血管生成

8、岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过AKT/mTOR信号通路下调CXCL10表达促进食管鳞状细胞癌血管生成

   肿瘤微环境（TME）中的细胞因子在促进肿瘤进展和血管生成中发挥关键作用。作者的富集分析表明，趋化因子信号通路参与岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p介导的致癌作用（图7A）。为进一步探究这一机制，作者用（miR-OE）岩藻糖基化外泌体或（miR-OE NC）岩藻糖基化外泌体处理HUVECs，通过人类细胞因子芯片分析细胞因子谱。岩藻糖基化外泌体处理后，CXCL10（也称为IP10）表达的显著降低引起了作者的关注（图8A）。CXCL10是一种已知的血管生成抑制剂，通过CXCR3依赖性和非依赖性途径发挥抗血管生成作用，包括抑制内皮细胞增殖、迁移和存活，以及诱导内皮细胞凋亡。CXCL10的抗血管生成特性已在多种癌症中得到广泛报道。例如，miR-21-5p通过抑制CXCL10表达促进ESCC血管生成。这些观察结果使作者推测，CXCL10可能是岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p调控的AKT/mTOR信号通路的下游效应因子。

图8.岩藻糖基化外泌体 miR-6842-3p 通过调控 AKT/mTOR 信号通路下调 CXCL10 表达，进而促进食管鳞状细胞癌血管生成

   随后的酶联免疫吸附测定（ELISA）实验显示，与对照组相比，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体显著降低HUVECs中CXCL10的分泌（图8B）。相反，（miR-OE + GW4869）岩藻糖基化外泌体处理则增加CXCL10分泌（图8B）。此外，AKT抑制剂伊帕替尼和mTOR抑制剂雷帕霉素均能逆转（miR-OE）岩藻糖基化外泌体诱导的CXCL10下调（图8C、D）。同时，过表达CXCL10几乎完全挽救了（miR-OE）岩藻糖基化外泌体介导的HUVECs中CXCL10表达（图8E）。功能挽救实验进一步显示，过表达CXCL10显著减弱（miR-OE）岩藻糖基化外泌体的促血管生成作用，包括HUVECs增殖、迁移和管腔形成（图8F-H）。重要的是，体内Matrigel栓实验结果显示，过表达CXCL10也可逆转miR-6842-3p过表达在Matrigel栓中诱导的血管生成表型（图8I-K）。综上，这些结果表明，岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过AKT/mTOR信号通路下调CXCL10表达，从而促进ESCC血管生成。

9、岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过调控AKT/mTOR信号通路下调IRF1表达，进而抑制CXCL10产生

   为阐明岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p升高抑制CXCL10表达的机制，作者首先参考了相关前期研究。在肝细胞癌中，近期研究表明IRF1 mRNA水平与CXCL10呈正相关，并在CXCL10启动子区域鉴定出IRF1应答元件。此外，染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）分析证实，IRF1结合可增强CXCL10转录，进而激活抗肿瘤免疫。值得注意的是，已有研究显示PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制也可通过IRF1上调CXCL10和CXCL11表达。基于这些发现，作者推测岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p可能通过调控AKT/mTOR信号通路降低IRF1（CXCL10的转录调控因子）的表达，从而调控CXCL10的产生。

   作者首先通过Western blot检测HUVECs中IRF1蛋白水平。结果显示，与对照组相比，（miR-OE）岩藻糖基化外泌体处理的细胞中IRF1表达显著降低，（miR-KD）岩藻糖基化外泌体处理的细胞中IRF1表达显著升高，证实（miR-OE）岩藻糖基化外泌体可下调HUVECs中IRF1表达（图9A）。鉴于PI3K/AKT/mTOR通路的抑制可通过IRF1上调CXCL10和CXCL11，作者进一步探究PTEN/AKT/mTOR通路是否在岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p下游调控IRF1表达。挽救实验结果显示，过表达PTEN可部分逆转（miR-OE）岩藻糖基化外泌体对HUVECs中IRF1表达的影响（图9B）。此外，AKT抑制剂伊帕替尼或mTOR抑制剂雷帕霉素处理可消除（miR-OE）岩藻糖基化外泌体诱导的IRF1下调（图9C、D）。综上，这些结果表明，岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过调控AKT/mTOR信号通路降低IRF1表达。

图9.岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过调控AKT/mTOR信号通路下调IRF1表达，从而抑制CXCL10产生

   鉴于IRF1作为调控CXCL10表达的主要转录因子，作者进一步探究IRF1是否在转录水平增强CXCL10表达。与前期研究一致，作者对癌症基因组图谱（TCGA）数据的分析显示，ESCC组织中IRF1与CXCL10表达呈显著正相关。为阐明IRF1介导的CXCL10调控的分子机制，作者首先利用生物信息学工具预测人类CXCL10启动子区域中的五个潜在IRF1结合基序。随后通过ChIP-qPCR验证IRF1在这些预测位点的结合情况。与免疫球蛋白G（IgG）对照组相比，ChIP-qPCR结果显示，在使用抗IRF1抗体进行免疫沉淀的HUVECs细胞裂解物中，IRF1在靶点1-3处的富集最强。值得注意的是，当使用抗IRF1抗体进行免疫沉淀时，在含有保守元件的区域检测到最高的IRF1富集（图9E-J）。综上，这些结果表明IRF1促进HUVECs中CXCL10转录。结合作者之前的结果，这证实岩藻糖基化外泌体miR-6842-3p通过下调IRF1表达抑制CXCL10产生，而这一过程是通过调控AKT/mTOR信号通路介导的。

参考文献

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