小胶质细胞TBK1信号传导促进乳腺癌脑转移

   乳腺癌脑转移瘤（Breast cancer brain metastasis，BCBM）是脑肿瘤最常见和最致命的形式，其特征是肿瘤相关小胶质细胞（tumor-associated microglia, TAM）大量浸润。TAMG可以促进转移性乳腺癌细胞的播种和生长，因此需要阐明其功能的分子机制，以便开发有效的策略来靶向TAMG在BCBM中的作用。在这项研究中，作者使用BCBM患者的肿瘤样本和小鼠模型，以及体外小胶质细胞培养系统，作者证明了tank结合激酶1（TBK1）信号在TAMG中富集和激活。TBK1在TAMG中的抑制作用减少了乳腺癌细胞的上皮-间质转化、迁移、侵袭和增殖。通过对转录组谱、患者生存数据和分泌组数据的综合分析，以及随后的实验验证，GM-CSF被确定为介导TBK1调控的乳腺癌细胞转移行为的关键分泌蛋白。BCBM小鼠模型中TBK1的药理抑制可减少BCBM并延长生存期。总之，这些数据表明TAMG中的TBK1信号有助于BCBM，并且与其下游效应物GM-CSF一起，代表了这种致命疾病的有希望的治疗靶点。该文章于2025年9月发表在《Cancer Research》，IF：16.6。

技术路线：

主要研究结果：

1. TBK1信号在BCBM肿瘤的TAMG中表达并激活

   为明确TBK1信号在BCBM肿瘤中的表达模式，作者分析了肿瘤免疫微环境（TIME）数据集的RNA-Seq数据。与肿瘤细胞、中性粒细胞和T细胞相比，TBK1特征在小胶质细胞和巨噬细胞中富集。为验证该结果，作者在4T1 BCBM肿瘤中进行流式细胞术分析，发现P-TBK1在CD45^lowCD11b⁺细胞（如小胶质细胞）和CD45^highCD11b⁺细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）中高表达，而在CD45-癌细胞和CD45+CD11b-淋巴细胞中几乎不表达（图1A）。既往研究强调CNS驻留髓系细胞在BCBM中的作用，促使作者聚焦TAMG中的TBK1。免疫荧光染色显示，在MDA-MB-231-Br和4T1模型（图1B）及患者（图1C）的BCBM肿瘤中，P-TBK1与小胶质细胞标志物TMEM119高度共定位。为确认TBK1能否在TAMG中被激活，作者用原发乳腺癌细胞及其配对BCBM细胞的条件培养基（CM）处理小胶质细胞。蛋白印迹显示，MDA-MB-231和BT-474细胞的CM可提高HMC3小胶质细胞中P-TBK1的表达，而MDA-MB-231-Br和BT-474-Br细胞的CM进一步放大该效应（图1D、E）。同样，4T1细胞的CM也增强了SIM-A9小胶质细胞中的P-TBK1（图1F）。综上，TBK1信号在BCBM肿瘤的TAMG中富集并被激活。

图1 TBK1信号在BCBM的TAMG中被富集和激活

2. 抑制TAMG中的TBK1可削弱乳腺癌细胞的EMT

   为探究TBK1在BCBM中的作用，作者在有无TBK1抑制剂的情况下，让乳腺癌细胞与TAMG“对话”，并检测对转移至关重要的EMT过程（图2A）。模拟TME时，先用癌细胞CM“教育”小胶质细胞，再用这些肿瘤教育后的小胶质细胞上清（T-CM）处理乳腺癌细胞，以评估TAMG对癌细胞EMT、迁移和侵袭的调控（图2A）。RT-qPCR显示，HMC3和SIM-A9的T-CM可上调间质基因VIM（图2B、C）、SNAI1和ZEB1的表达；若提前用TBK1抑制剂BX795或Amlexanox（Amlex）处理小胶质细胞，这一诱导效应即被抵消。尽管T-CM本身对MDA-MB-231-Br和4T1的上皮基因CDH1表达无显著影响，但加入BX795或Amlex后，CDH1水平显著回升（图2D、E）。蛋白层面，微胶质T-CM升高了癌细胞中间质标志物vimentin和N-cadherin的蛋白量，而BX795或CMPD-1可逆转这一变化；同时，经TBK1抑制剂处理的微胶质细胞所分泌的T-CM，还能上调MDA-MB-231-Br和4T1细胞中上皮标志物E-cadherin的蛋白水平（图2F、G）。综上，TBK1信号对TAMG诱导的乳腺癌细胞EMT不可或缺。

3. TBK1在TAMG中的抑制作用会损害乳腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖

   为确认TBK1调控的TAMG在BCBM中的功能，本研究采用Transwell体系开展体外实验。结果显示，原代人小胶质细胞及HMC3小胶质细胞来源的T-CM显著增强MDA-MB-231-Br与BT-474-Br细胞的横向迁移能力；在小胶质细胞阶段予以TBK1抑制剂BX795或CMPD-1干预后，该促迁移效应被完全阻断（图2H、2I）。同样，BX795与CMPD-1可消除原代小鼠小胶质细胞及SIM-A9小胶质细胞T-CM诱导的4T1细胞迁移增强（图2J）。侵袭实验进一步表明，上述人源及HMC3小胶质细胞T-CM可显著提升MDA-MB-231-Br与BT-474-Br细胞的跨基质侵袭能力；于小胶质细胞水平实施TBK1药理抑制后，该增强作用被完全拮抗（图2K、2L）。4T1细胞在接受原代小鼠小胶质细胞及SIM-A9小胶质细胞T-CM处理时亦呈现一致结果，TBK1抑制剂的存在使其侵袭能力恢复至基线水平（图2M）。综上，TAMG内TBK1信号活性是乳腺癌细胞迁移、侵袭及增殖能力获得的关键调控节点。

图2 TBK1介导的TAMG促进乳腺癌细胞EMT、迁移和侵袭

   为明确TAMG内TBK1信号对乳腺癌细胞增殖及存活的影响，作者采用CFSE增殖实验与Annexin V/PI凋亡检测。结果显示，HMC3与SIM-A9小胶质细胞来源的T-CM可显著促进MDA-MB-231-Br、BT-474-Br及4T1细胞的增殖；而在小胶质细胞层面以BX795或CMPD-1抑制TBK1后，上述促增殖效应被完全抵消。值得注意的是，TBK1抑制并未诱导MDA-MB-231-Br、BT-474-Br或4T1细胞发生明显凋亡。为进一步验证TAMG-TBK1对转移的特异性调控作用，作者在癌细胞内分别实施TBK1基因敲低及药理学抑制。结果表明，4T1与MDA-MB-231-Br细胞自身TBK1活性的丧失并未改变其增殖、凋亡及EMT表型。综上，TBK1信号在TAMG而非癌细胞自主层面，对乳腺癌细胞的迁移、侵袭及增殖具有决定性调控作用。

图3 TBK1调控的GM-CSF在TAMG中促进乳腺癌细胞的EMT、迁移和侵袭

4. 小胶质细胞TBK1信号通过分泌GM-CSF促进乳腺癌细胞EMT、迁移、侵袭及增殖

   为阐明TBK1调控的TAMG在BCBM中的功能机制，本研究采用以下无偏策略：①利用TIME数据集筛选TAMG相较正常小胶质细胞显著上调的前50个基因（P≤0.05）；②结合人分泌蛋白组数据库锁定编码分泌蛋白的基因；③保留与BCBM患者总生存期呈负相关的基因；④在独立TIME数据集中验证上述基因在TAMG中的富集。综合筛选后，CSF2（编码GM-CSF）被确定为关键候选因子（图3A）。

   为验证TBK1对CSF2的调控作用，以MDA-MB-231-Br细胞条件培养基（CM）刺激HMC3小胶质细胞，并施加TBK1抑制剂BX795、CMPD-1或Amlex。RT-qPCR结果显示，MDA-MB-231-Br CM诱导的CSF2表达上调可被TBK1抑制剂完全阻断（图3B）。进而，利用shRNA在HMC3及SIM-A9小胶质细胞中敲低CSF2（图3C、3D），发现肿瘤教育后的小胶质细胞CSF2缺失可下调MDA-MB-231-Br及4T1细胞中vimentin、N-cadherin表达，并上调E-cadherin（图3E、3F）。对应地，接受CSF2敲低小胶质细胞T-CM处理的MDA-MB-231-Br及4T1细胞，其迁移（图3G）、侵袭（图3H）及增殖能力（图3I、3J）均显著降低。

   最后，于4T1细胞中敲低CSF2受体CSF2RA，以验证GM-CSF是否通过该受体发挥功能。结果表明，CSF2RA缺失可完全阻断GM-CSF诱导的EMT、迁移、侵袭及增殖。综上所述，TBK1调控的GM-CSF是TAMG诱导乳腺癌细胞EMT、迁移、侵袭及增殖的关键介导因子。

5. TBK1抑制减轻BCBM并延长生存期。

   为在体验证TBK1信号在BCBM中的功能，本研究经颈内动脉注射将MDA-MB-231-Br细胞接种至裸鼠，构建脑转移模型，随后给予具有中枢穿透性的TBK1抑制剂BX795或Amlex。结果显示，TBK1抑制显著降低脑转移负荷（图4A）并延长总生存期（图4B）。进一步探究TBK1对已定植BCBM的作用时，采用颅内直接注射MDA-MB-231-Br细胞的方式模拟肿瘤已驻留脑实质的状态。BX795或Amlex治疗仍可抑制脑内肿瘤继续扩增（图4C）。组织学层面，免疫荧光检测显示，经BX795或Amlex处理后，BCBM组织中EMT相关间充质标志物N-cadherin、vimentin及增殖标志物Ki67表达下调（图4D-4F），而上皮标志物E-cadherin表达上调（图4G）。综上，TBK1在BCBM进展中具有关键调控作用，并支持其作为BCBM患者潜在治疗靶点。

图4 抑制TBK1可减少BCBM和EMT，延长生存期

结论：

   本研究证实，TBK1在乳腺癌脑转移（BCBM）肿瘤相关小胶质细胞（TAMG）中呈显著富集且活性增强，其信号通过诱导乳腺癌细胞发生上皮-间充质转化（EMT）、迁移及侵袭，从而加速脑转移进程。在BCBM小鼠模型中，给予具有中枢穿透性的TBK1抑制剂可显著降低脑转移负荷、抑制已定植肿瘤的颅内生长，并延长总体生存期。上述发现不仅阐明了TAMG促进BCBM的分子机制，亦提示TBK1具备可转化的治疗靶点价值。

参考文献：

Fatima Khan, Edgar Petrosyan, Yang Liu, Atousa Bahrami, Erfan Taefi, Changiz Geula, Maciej S. Lesniak, Peiwen Chen; Microglial TBK1 Signaling Promotes Breast Cancer Brain Metastasis. Cancer Res 2025