FGFR4在结肠癌中通过CXCL10-CXCR3轴促进CAF激活

   癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过与肿瘤微环境中的肿瘤和免疫细胞的串扰促进癌症的恶性表型。因此，需要深入研究CAF激活的机制，以制定针对CAF的癌症免疫治疗策略。在这项研究中，作者研究了FGFR4在结肠癌CAF调控中的作用。FGFR4过表达的癌细胞在体内促进了CAF的丰度和激活，同时也通过其分泌组诱导正常成纤维细胞向CAF分化。机制上，FGFR4通过上调toll样受体3-干扰素调节因子-干扰素β （IFNβ）信号传导和IFNβ的自分泌作用诱导CXC趋化因子配体（CXCL）10的产生。CXCL10增加了成纤维细胞中CAF标记物的表达，包括α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。CXCL10还促进了CAF的迁移、侵袭和收缩，这反映了CAF的激活。相反，敲除CXCL10或中和抗体可消除成纤维细胞中CAF标记物的表达。CXCL10的同源受体CXCR-3的抑制也会损害CAF的功能。在人类结肠癌样本中，FGFR4和CXCL10的表达与CAF标志物的表达呈正相关。最后，FGFR4和CXCR3的双重抑制抑制了肿瘤生长，并伴有CAF的下调。作者的研究结果揭示了FGFR4通过CXCL10-CXCR3轴促进TME中CAF分化/激活的机制，突出了FGFR4和CXCR3共同靶向作为基质显性肿瘤患者治疗策略的潜力。该文章于2025年2月发表在《Cell Death Disease》，IF：9.6。

技术路线：

摘要图

主要研究结果：

1.FGFR4促进肿瘤生长及TME中CAF分化/激活

   为探究FGFR4过表达对肿瘤生长与CAF激活的影响，作者利用小鼠结肠癌CT-26/EV或CT-26/FGFR4稳定表达细胞系建立皮下移植瘤模型。接种CT-26/FGFR4的异种移植小鼠肿瘤生长速度与重量显著增加。TME中α-SMA阳性细胞数量显著增多，提示癌细胞FGFR4过表达可提升TME内CAF丰度（图1A–C）。

   作者进一步研究FGFR4在TME中对CAF激活的作用。分别来源于CT-26/EV或CT-26/FGFR4肿瘤的CAF中，评估CAF标志物及其激活状态。与CT-26/EV组相比，CT-26/FGFR4肿瘤来源的CAF在mRNA与蛋白水平均呈现更高的CAF标志物表达，包括α-SMA、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、PDGF受体（PDGFR）及波形蛋白（图1D）。免疫荧光实验证实，CT-26/FGFR4来源的CAF α-SMA表达升高，且呈现明显的细长梭形形态（图1E）。通过侵袭实验及胶原凝胶收缩实验验证其激活状态，结果显示侵袭能力与收缩力均增强（图1F、G）。上述结果表明，FGFR4在TME中促进肿瘤进展，并伴随CAF激活。

图1 FGFR4在体内促进肿瘤生长和CAF激活

2.FGFR4通过分泌组诱导CAF分化与激活

   为探究肿瘤分泌组对正常成纤维细胞向CAF分化的影响，作者将NIH/3T3成纤维细胞与稳定癌细胞或其条件培养基（CM）共培养，并通过Western blot检测CAF标志物表达以评估分化程度。与体内结果一致，在共培养及CM处理体系中，Fgfr4高表达癌细胞通过分泌组显著诱导NIH/3T3细胞表达α-SMA、波形蛋白等CAF标志物，提示Fgfr4高表达肿瘤来源分泌组参与CAF分化（图2A）。此外，与CT-26/EV来源CM相比，CT-26/FGFR4来源CM显著增强NIH/3T3细胞的增殖、迁移、侵袭及收缩能力，表明静息成纤维细胞的CAF分化得以促进（图2B、C）。为进一步验证肿瘤分泌组对CAF激活的作用，作者从CT-26接种瘤中分离CAF，用CT-26稳定癌细胞CM培养并评估CAF活性。与CT-26/EV来源CM相比，CT-26/FGFR4来源CM显著增强CAF激活。上述结果证实，FGFR4通过其分泌组促进CAF分化与激活。

图2 FGFR4通过其分泌组诱导CAF分化和激活

3.FGFR4过表达结肠癌细胞的转录组分析

   RNA-seq数据的主成分分析（PCA）图显示，CT-26/FGFR4与CT-26/EV对照细胞明显分离，表明FGFR4过表达导致基因表达谱显著不同（图3A）。对CT-26/EV与CT-26/FGFR4细胞进行RNA-seq分析，发现与EV对照相比，Fgfr4过表达细胞中有96个基因上调、44个基因下调（fold-change > 2，P < 0.001）（图3B）。Reactome通路分析显示，上调基因与干扰素（IFN）信号、涉及IFN刺激基因的抗病毒机制、免疫系统及细胞因子信号相关（图3C）。基因集富集分析（GSEA）亦显示，干扰素α应答、干扰素γ应答及细胞因子信号等免疫相关通路富集，提示FGFR4过表达强烈激活免疫与干扰素信号通路（图3D）。值得注意的是，Ifnβ1及其下游靶基因——IFN诱导蛋白10（IP-10/Cxcl10）被FGFR4过表达特异性上调（图3E、F）。Ifnβ与Cxcl10编码的分泌分子与TLR3-TBK-IRF及IFN-信号转导与转录激活因子（STAT）-CXCL10信号通路相关，这些通路与Reactome和GSEA分析中上调的通路重叠。ELISA验证显示，FGFR4过表达显著增加IFN-β与CXCL10的产生（图3G）。

4.FGFR4通过激活TLR3-IRF-IFNβ轴诱导结肠癌中CXCL10表达

   Western blot分析证实，FGFR4过表达的结直肠癌细胞中，IFN-β与CXCL10表达升高，TBK1、IRFs及STAT1的磷酸化水平亦增加（图4A），提示TLR3-TBK-IRF与IFNβ-STAT-CXCL10信号通路被FGFR4过表达激活。反之，使用siRNA敲低FGFR4或给予FGFR4抑制剂BLU9931处理后，TBK1、IRF及STAT1的磷酸化水平下降，IFN-β与CXCL10表达减少（图4B）。此外，RT-qPCR显示，敲低或抑制FGFR4显著降低IFN-β与CXCL10的mRNA水平（图4C、D）。ELISA进一步验证，FGFR4敲低导致CXCL10分泌减少。综上，FGFR4通过激活TLR3-TBK-IRF信号及IFNβ自分泌作用，调控结肠癌细胞中CXCL10的表达与产生。

5.CXCL10诱导成纤维细胞向CAF分化

   FGFR4过表达癌细胞可诱导CAF分化/激活，其CXCL10浓度亦高于对照细胞（图2、图3G）。为明确FGFR4介导的CXCL10分泌是否以旁分泌方式调控TME内CAF分化/激活，作者检测CXCL10是否直接调控成纤维细胞向CAF分化/激活。重组CXCL10处理可提高NIH/3T3成纤维细胞的收缩力、迁移、侵袭能力及CAF标志物表达，表明CXCL10可直接诱导成纤维细胞向CAF分化（图5A–C）。由此提示，FGFR4过表达细胞分泌的CXCL10可能在调控CAF分化/激活中起关键作用。

图3 过表达FGFR4的结肠癌细胞的转录组分析

6.FGFR4通过CXCL10-CXCR3轴诱导CAF分化与激活

   作者进一步评估CXCL10在分泌组介导的CAF分化中的关键性。与si-阴性对照（NC）组相比，si-CXCL10处理的CT-26/FGFR4细胞的CM可降低α-SMA与波形蛋白表达（图5D）。为阻断分泌型CXCL10，作者亦检测CXCL10中和抗体对CM介导CAF分化的影响。CXCL10中和抗体处理可降低CT-26/FGFR4-CM在NIH/3T3成纤维细胞中诱导的α-SMA与波形蛋白基因表达（图5E）。结果提示，FGFR4通过分泌CXCL10诱导CAF分化与激活。

图4 FGFR4通过激活TLR3 - TKB - IRF轴和IFNΒ的自分泌作用诱导CXCL10分泌

   作者检测CXCL10配体受体CXCR3是否参与CXCL10介导的CAF分化/激活。CXCR3拮抗剂AMG487处理可降低CM诱导的α-SMA与波形蛋白基因表达，表明CXCL10-CXCR3轴在CAF分化中起核心作用（图5F）。此外，AMG487及其他CXCR3抑制剂抑制CXCR3活性后，CT-26/FGFR4来源CAF的侵袭能力下降（图5G、H）。综上，FGFR4过表达通过CXCL10-CXCR3轴诱导CAF分化/激活。

图5 FGFR4通过CXCL10-CXCR3轴诱导CAF分化和激活

7.FGFR4表达与CAF标志物在结肠癌中呈正相关

   利用结肠癌患者临床样本评估FGFR4、CXCL10与CAF标志物表达的相关性。采用RT-qPCR分析137例Ⅱ–Ⅲ期结肠癌患者肿瘤及配对正常组织（各137例）的基因表达水平。与正常组织相比，肿瘤组织中FGFR4、CXCL10及CAF标志物表达显著上调（图6A）。在癌组织中，FGFR4表达与CXCL10（Pearson R = 0.32；P < 0.001）及CAF标志物α-SMA（Pearson R = 0.43；P < 0.0001）、PDGFR-β（Pearson R = 0.46；P < 0.0001）、FAP（Pearson R = 0.32；P < 0.001）均呈显著正相关（图6B）。CXCL10表达亦与α-SMA（Pearson R = 0.30；P < 0.001）、PDGFR-β（Pearson R = 0.32；P < 0.001）、FAP（Pearson R = 0.53；P < 0.0001）呈正相关（图6C）。上述结果强烈支持临床结肠癌样本中FGFR4、CXCL10与CAF标志物表达存在关联，并显示FGFR4参与结肠癌TME内CAF分化/激活，凸显所发现的FGFR4-CXCL10-CAF调控轴的临床相关性。

图6 结直肠癌患者组织样本中CAF标记物与FGFR4或CXCL10表达的相关性分析

8.FGFR4与CXCR3双重抑制通过抑制CAF阻断结肠癌生长

   作者研究了FGFR4和CXCR3抑制剂能否抑制肿瘤生长及CAF分化。FGFR4抑制剂BLU9931单药即可减缓肿瘤进展，联合CXCR3抑制剂AMG487后抑制效应进一步增强，凸显两药协同（图7A）。通过监测体重及血生化评估毒性：各治疗组体重平稳，ALT、AST、BUN等指标正常，未见显著全身毒性（图7B）。

   对肿瘤来源的预富集CAF（基质富集组分）行Western blot显示，BLU9931与AMG487联用后α-SMA表达下降，提示CAF受抑（图7C）。IHC证实，双重阻断减少TME内α-SMA与Ki-67阳性细胞，表明CAF分化减弱、肿瘤增殖受抑（图7D）。

图7 体内抑制FGFR4和CXCR3的CAF失活和抗肿瘤效率

   进一步通过CD8、CD86、CD206免疫组化评估免疫调节：联合治疗增加CD8⁺T细胞浸润，降低CD206⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAM），并提升代表M1型的CD86⁺细胞，提示免疫微环境向抗肿瘤表型转化。综上，FGFR4与CXCR3双重抑制可在体内抑制肿瘤生长，其机制与阻断CAF分化并重塑免疫微环境相关。

结论：

   总之，癌细胞中的FGFR4通过TLR3-IRF-IFN Β依赖的信号传导促进CXCL10的产生，随后诱导CAF分化和激活，最终导致结肠癌的进展。双重抑制FGFR4和CXCR3通过下调CAF抑制肿瘤生长。因此，通过抑制FGFR4/CXCR3抑制CAF具有克服治疗耐药性的潜力。

参考文献：

Sun, EG., Choi, JN., Park, MR. et al. FGFR4 promotes CAF activation through the CXCL10-CXCR3 axis in colon cancer. Cell Death Dis 16, 424 (2025). /10.1038/s41419-025-07588-y