抑癌基因SLC9A2通过抑制血管生成阻断结直肠癌转移并逆转免疫治疗耐药

   结直肠癌（CRC）是一种常见且侵袭性强的恶性肿瘤，常转移至肝脏，治疗面临巨大挑战。尽管其临床意义重大，CRC肝转移及免疫治疗耐药的机制仍不清楚。本研究采用新策略——构建高转移CRC细胞系——探讨驱动CRC转移的分子机制。为明确特定基因在CRC肝转移中的作用，作者对原代CRC细胞持续施加选择压力，建立两株高转移细胞系（LoVo-Hm与HCT116-Hm）。RNA测序筛选转移细胞中差异表达基因，并通过迁移、侵袭、血管生成实验及ELISA检测VEGFA分泌，验证SLC9A2功能。结果在人CRC组织及公共数据集中进一步验证，以评估其临床意义。高转移CRC细胞系中SLC9A2显著下调。机制上，SLC9A2通过抑制STAT3信号通路阻断上皮-间质转化（EMT）及转移；同时减少VEGFA分泌，使肿瘤血管正常化并重塑肿瘤微环境（TME），最终增强抗肿瘤免疫。CRC组织分析显示，肿瘤组织SLC9A2表达低于邻近正常组织，且与TNM分期呈负相关。重要的是，免疫治疗队列中SLC9A2高表达者治疗反应更佳。SLC9A2通过调控STAT3通路及肿瘤血管，在CRC转移、血管生成及TME重塑中发挥关键作用，可作为潜在预后生物标志物和治疗靶点。靶向SLC9A2有望增强免疫应答、改善CRC治疗效果，为未来治疗策略提供新方向。该文章于2025年6月发表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF：12.8。

技术路线：

主要研究结果：

1.高转移性CRC模型构建及转移驱动基因探索  

   肿瘤异质性体现在增殖、转移、耐药等多个方面。为研究这些特征，作者选取源自原发CRC的HCT116细胞系和来自淋巴结转移的LoVo细胞系作为基础，施加体内外持续选择压力，成功构建高转移株HCT116-Hm与LoVo-Hm（图1A）。与亲本细胞相比，筛选获得的细胞迁移和侵袭能力显著增强（图1B-C）。腹腔播散及脾-肝转移模型进一步证实该筛选体系可有效获得高转移能力细胞（图1D-E）。对LoVo及其高转移衍生物LoVo-Hm进行转录组测序，比较表达谱变化（图1F）；同时分析包含原发CRC及配对肝转移数据的GSE14297数据集（图1G）。首先过滤FPKM>0的基因，再以|log₂FC|>2、FDR<0.05为标准筛选差异基因，取上调及下调前20位。将该结果与GSE14297中原发瘤与肝转移瘤的差异基因交集，仅SLC9A2同时出现，遂确定其为后续研究对象（图1H）。值得注意的是，SLC9A2在LoVo-Hm中显著下调，在肝转移组织中也低于原发瘤。  

图1：结直肠癌肝转移中SLC9A2表达下调

   利用GSE146771单细胞数据进一步验证SLC9A2表达是否局限于肿瘤细胞。结果显示，该基因仅在恶性上皮细胞中表达，基质及免疫细胞未见信号（图1I）。GSE178341数据集亦证实SLC9A2表达局限于肿瘤上皮成分（图1J-M）。再次分析GSE14297发现，原发瘤（PT）SLC9A2水平显著低于肝转移（LM）（图1N）。构建原发CRC与肝转移配对类器官（图1O），H&E染色显示类器官具有核质比异常等典型肿瘤特征，病理检测证实其表达CRC标志（图1Q）。提取3例患者来源类器官蛋白，定量显示肝转移类器官SLC9A2蛋白水平显著低于原发瘤类器官（图1P）。LoVo与LoVo-Hm细胞中SLC9A2 mRNA及蛋白检测均提示高转移株表达显著降低（图1R）。TCGA数据库Kaplan-Meier分析显示，SLC9A2 mRNA水平与CRC患者总生存呈正相关。

2.SLC9A2低表达与结直肠癌患者TNM分期晚期及预后不良相关  

   SLC9A2在转移灶中显著下调，并与CRC患者不良预后密切相关。为明确其与临床特征的关系，作者整合GEO与TCGA公共数据集进行分析。结果显示，SLC9A2表达水平是CRC患者总生存（OS）、无复发生存（RFS）、疾病特异生存（DSS）及无进展生存（PFS）的有利预测因子（图2A）。利用TCGA及三个GEO数据集检测CRC标本中SLC9A2 mRNA表达，结果一致表明肿瘤组织表达显著低于邻近正常组织（图2B）。此外，微卫星高度不稳定（MSI-H）CRC标本的SLC9A2表达高于微卫星稳定（MSS）标本（图2C）。值得注意的是，TNM晚期患者SLC9A2转录水平显著降低（图2D），且其表达随T、N、M分期进展呈阶梯式下降（图2E-G）。通过Timer数据库分析SLC9A2表达与免疫细胞浸润的关系，发现其与肿瘤相关成纤维细胞及M2型巨噬细胞呈负相关，而与CD8⁺ T细胞呈正相关（图2H）。进一步评估SLC9A2对免疫治疗的影响，结果显示其与LAG3、CTLA4、CD274、TGFB1、TIGIT、ADORA2A、CSF1R、KDR等8种免疫检查点分子均呈负相关（图2I），提示SLC9A2可能增强免疫治疗疗效。为验证上述关联，作者分析CRC免疫治疗单细胞数据集GSE178341，发现基线组织高表达SLC9A2的患者对免疫治疗反应良好，而低表达者均无治疗响应（图2J-M）。

图2：SLC9A2低表达与不良临床特征相关并伴随免疫抑制微环境

3.SLC9A2体外抑制CRC细胞恶性进展  

   为验证SLC9A2在CRC中的抑癌功能，作者采用过表达质粒及siRNA分别上调和下调其表达，RT-qPCR证实转染效率（Figure S1）。鉴于SLC9A2源自转移模型，重点考察其对迁移与侵袭的影响。Transwell实验显示，敲低SLC9A2后，穿膜细胞数显著减少，Matrigel侵袭能力亦降低（图3A-B）。反之，在LoVo-Hm细胞中恢复SLC9A2表达，穿膜及侵袭细胞数均下降（图3C）。划痕实验进一步证实：siRNA组LoVo细胞迁移距离增加（图3D），而过表达SLC9A2的LoVo-Hm细胞迁移距离缩短（图3E）。上述结果提示SLC9A2抑制CRC细胞迁移与侵袭。

   EMT是肿瘤转移的关键环节，与迁移、侵袭密切相关。GSEA分析显示，SLC9A2低表达组EMT信号显著富集（图3F）；且SLC9A2与上皮标志物CDH1正相关，与间质标志物CDH2、SNAIL1负相关（图3F），提示其抑制EMT进程。Western blot进一步验证：敲低SLC9A2后，间质标志物N-cadherin、Snail上调，上皮标志物E-cadherin、Claudin-1下调；过表达SLC9A2则呈现相反趋势（图3G-H）。综上，SLC9A2通过抑制EMT阻断CRC细胞迁移与侵袭。

图3：SLC9A2抑制CRC细胞迁移侵袭并逆转EMT进程

4.SLC9A2体内抑制结直肠癌肝转移  

   为验证SLC9A2的体内功能，作者采用CRC脾-肝转移模型评估其对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。结果显示，与对照组相比，SLC9A2过表达组肝脏转移结节数量显著减少（图4A-E）。肝组织H&E染色亦显示，SLC9A2过表达组转移灶明显减少（图4F）。免疫组化（IHC）结果显示，SLC9A2过表达显著上调上皮标志物E-cadherin表达，下调间质标志物N-cadherin和Snail表达。此外，作者检测了肝转移组织中血管生成标志物CD31的表达水平，发现SLC9A2过表达组肿瘤组织中CD31表达显著降低，提示SLC9A2可能参与肿瘤血管生成过程（图4G）。进一步，作者对同一患者的原发CRC病灶及对应肝转移灶进行IHC染色，发现SLC9A2在原发肿瘤中的表达高于肝转移灶，而CD31在肝转移灶中的表达高于原发灶。该结果进一步支持SLC9A2与CD31之间的负相关关系，提示SLC9A2在肿瘤血管生成中发挥作用（图4H）。此外，作者收集肝转移灶标本进行RT-qPCR和Western blot分析。如图4I-J所示，SLC9A2过表达在mRNA和蛋白水平均上调E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin表达。综上，SLC9A2在体内可抑制结直肠癌的血管生成和转移。

图4：SLC9A2在体内抑制结直肠癌肝转移

5.SLC9A2通过抑制JAK/STAT3信号通路阻断结直肠癌转移  

   随后，作者探讨SLC9A2抑制CRC转移的分子机制。对SLC9A2过表达及对照细胞进行RNA测序，KEGG分析显示差异基因富集于JAK/STAT信号通路（图5A）。鉴于JAK/STAT3通路激活参与肿瘤发生、进展、侵袭及转移，作者首先检测STAT3第705位酪氨酸磷酸化（p-STAT3^Y705^）水平。敲低SLC9A2后，HCT116与LoVo细胞中p-STAT3^Y705^表达升高（图5B）；反之，在HCT116-Hm与LoVo-Hm中过表达SLC9A2则显著下调p-STAT3^Y705^（图5C）。为证实SLC9A2缺失主要通过促进p-STAT3^Y705^累积及其核转录激活发挥作用，作者采用STAT3磷酸化抑制剂Stattic。Stattic处理可完全阻断敲低SLC9A2所致的p-STAT3^Y705^升高（图5D）。核-质分离实验显示，si-SLC9A2组细胞核内p-STAT3^Y705^蛋白水平显著高于si-NC组，而Stattic可抑制该效应（图5E）。免疫荧光进一步验证，SLC9A2过表达减少p-STAT3核转位（图5F-G）。功能层面，敲低SLC9A2显著促进HCT116与LoVo细胞迁移侵袭，而Stattic处理可明显逆转该效应（图5H-I）。此外，作者构建同一患者原发灶与肝转移灶来源的类器官模型（图5J）。在原发灶类器官中敲低SLC9A2，肝转移灶来源类器官p-STAT3^Y705^表达升高；反之，在肝转移灶类器官中过表达SLC9A2则抑制p-STAT3^Y705^水平（图5K）。小鼠肝转移模型组织Western blot亦证实，体内过表达SLC9A2可降低p-STAT3^Y705^（图5L）。综上，SLC9A2通过抑制p-STAT3^Y705^发挥抗肿瘤作用。

图5：SLC9A2通过抑制STAT3信号通路阻断CRC细胞迁移侵袭

6.SLC9A2通过抑制JAK/STAT3信号通路阻断结直肠癌转移  

   在高转移细胞中过表达SLC9A2可显著降低其体内肝转移能力。除通过抑制STAT3信号通路阻断肿瘤细胞迁移外，SLC9A2可能具备额外生物学功能以协同抑制CRC转移。差异基因GO分析显示，除JAK-STAT3通路外，VEGF信号通路亦显著富集，提示SLC9A2可能参与调控肿瘤血管生成（图6A）。血管生成是早期癌转移的关键环节，可促使肿瘤由休眠进入增殖期，加速生长与播散，故与CRC细胞的迁移侵袭能力密切相关。

   利用CancerSEA单细胞平台解析CRC单细胞转录组数据，发现SLC9A2表达与肿瘤恶性表型呈负相关，尤其与血管生成呈显著负相关（图6B-C），提示其具有抗血管生成潜能。IHC染色亦显示，肝转移灶SLC9A2表达低于原发瘤，而血管标志物CD31在SLC9A2低表达区呈高表达，进一步支持其抑制血管生成的功能（图4H）。鉴于VEGFA在肿瘤血管生成中的核心作用，作者考察SLC9A2与VEGFA的关联。TNMplot数据库相关性分析显示二者表达呈负相关（图6D）。采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行成管实验，发现SLC9A2过表达肿瘤细胞条件培养基显著抑制HUVEC管腔形成；反之，敲低SLC9A2则促进成管。CRC类器官中敲低SLC9A2同样增强HUVEC成管能力（图6E-G）。内皮细胞迁移是血管生成的重要步骤。Transwell实验表明，SLC9A2过表达细胞条件培养基显著抑制HUVEC迁移与侵袭，而敲低SLC9A2的条件培养基则起促进作用（图6H-I）。GO分析提示差异基因亦富集于JAK-STAT3通路。作者前期已证实高转移细胞通过下调SLC9A2激活STAT3通路，促进迁移侵袭，由此推测STAT3亦可能参与血管生成。为验证此假设，在SLC9A2敲低细胞中加入STAT3磷酸化抑制剂Stattic，发现其可逆转由SLC9A2缺失诱导的VEGFA上调（图6J）。成管、迁移及EdU增殖实验进一步显示，Stattic可挽救SLC9A2敲低所致的HUVEC成管、迁移与增殖增强效应（图6K-L）。因此，SLC9A2通过抑制STAT3通路发挥抗血管生成作用。裸鼠Matrigel plug实验亦获得一致结果。H&E及CD31 IHC显示，与HCT116 si-NC组相比，si-SLC9A2共培养组胶栓内可见大量新生血管；而过表达SLC9A2则显著减少体内血管生成（图6M-N）。综上，SLC9A2在体外与体内均可显著抑制HUVEC血管生成能力。

图6：SLC9A2抑制VEGFA表达并遏制肿瘤血管生成

7.SLC9A2通过抑制血管生成有效逆转结直肠癌免疫耐药  

   如图2所示，CRC免疫治疗队列中基线SLC9A2表达较高者治疗反应更佳。新近研究指出，抗血管生成治疗可增强效应T细胞浸润并促进血管正常化，同时减少调节性T细胞及髓源性抑制细胞招募[25]。据此，作者推测SLC9A2通过抑制STAT3通路阻断CRC转移与血管生成，进而协同增强免疫治疗疗效。为验证该假设，作者构建免疫治疗耐药亚系MC38-R：对MC38细胞长期低剂量诱导抗PD-1抗体，最终获得耐药株（图7A-B）。免疫治疗后皮下瘤IHC显示，MC38-R肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润显著减少，血管密度明显增加，证实肿瘤血管生成通路激活参与免疫耐药过程（图7C）。采用原位过表达策略，于MC38-R移植瘤内注射Slc9a2过表达质粒（前期体外转染已验证表达，图7O）。皮下成瘤10天后，小鼠接受两周瘤内注射：Slc9a2过表达质粒+递送缓冲液、空载质粒+递送缓冲液，以贝伐珠单抗为阳性对照。单独抗PD-1治疗对MC38-R移植瘤无效；而Slc9a2质粒或贝伐珠单抗均显著增强抗PD-1的抑瘤效果（图7D-G）。ELISA证实，Slc9a2过表达组肿瘤VEGFA水平下降（图7H）。CD31 IHC显示，OE-Slc9a2+anti-PD-1组与贝伐珠单抗+anti-PD-1组血管数量显著少于其余各组（图7J）。肿瘤浸润免疫细胞分析表明，上述两组CD8⁺ TILs数量增加（图7K）。TUNEL检测显示，OE-Slc9a2+anti-PD-1与贝伐珠单抗+anti-PD-1组凋亡细胞增多，EdU染色示增殖降低（图7L-M）。ELISA进一步验证，OE-Slc9a2+anti-PD-1处理可促进颗粒酶B/IFN-γ分泌，尤以IFN-γ升高显著（图7N）。Western blot证实瘤内Slc9a2过表达效率，并显示p-STAT3与VEGFA表达下降（图7P）。综上，Slc9a2通过抑制STAT3通路降低VEGFA表达，从而逆转免疫治疗耐药。

图7：Slc9a2通过抑制血管生成有效逆转结直肠癌免疫耐药

8.Ruxolitinib增强抗PD-1免疫治疗结直肠癌的疗效  

   目前尚无特异性上调SLC9A2表达的有效药物，亦缺乏针对STAT3通路激活的成熟靶向治疗。抑制STAT3上游信号成为可行策略，其中JAK为STAT3最关键的上游激酶。已有研究报道，JAK抑制剂Ruxolitinib可协同免疫治疗，提升霍奇金淋巴瘤及非小细胞肺癌的疗效[26,27]。鉴于Ruxolitinib亦能调控黑色素瘤细胞对抗PD-1的原发耐药[28]，作者推测其可通过抑制STAT3通路模拟SLC9A2功能，从而逆转CRC免疫治疗耐药。剂量探索实验显示，每日30 mg/kg Ruxolitinib联合免疫检查点抑制剂（Ruxolitinib+ICI）抑瘤效果最佳，且未表现肝、肾或肺毒性（图8A-D）。瘤内Western blot证实，Ruxolitinib显著抑制STAT3磷酸化并下调VEGFA表达（图8E）；ELISA亦显示VEGFA分泌减少（图8F）。此外，Ruxolitinib可刺激颗粒酶B及IFN-γ释放（图8G）。免疫组化结果显示，Ruxolitinib降低CD31⁺血管数量，增加CD8⁺ T细胞浸润，减少Ki67⁺增殖细胞，并提高TUNEL⁺凋亡细胞比例（图8H）。综上，Ruxolitinib联合抗PD-1方案在CRC治疗中具有潜在的临床转化价值。

图8：Ruxolitinib增强抗PD-1免疫治疗结直肠癌的疗效

参考文献：

Zhang, Z., Liu, S., Xu, T., Chen, N., Liu, C., Yang, H., Shi, Y., Li, Z., Feng, X., Yao, Y., Duan, X., Xu, G., Zhang, C., Wang, Z., Li, J., & Shen, L. (2025). Tumor suppressor SLC9A2 inhibits colorectal cancer metastasis and reverses immunotherapy resistance by suppressing angiogenesis. Journal of experimental & clinical cancer research : CR, 44(1), 172.13046-025-03422-7