m6A阅读器IGF2BP2稳定的lncRNA LHX1-DT抑制肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

   m6A已被确定为多种人类癌症的关键调节因子。然而，m6A修饰在肾癌（RCC）中的作用及其与长链非编码RNA LHX1-DT （LHX1-DT）的相互作用尚不清楚。通过微阵列分析鉴定差异表达的lncRNA和m6A水平。通过RNA免疫沉淀和荧光素酶报告基因检测IGF2BP2与LHX1-DT的相互作用。在RCC组织中发现LHX1-DT表达下调，并且LHX1-DT表达降低与RCC患者总生存率较差相关。功能实验表明，过表达LHX1- DT可显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭。METTL14介导的m6A读取器蛋白IGF2BP2识别LHX1-DT上的m6A修饰位点，促进其稳定性。此外，LHX1-DT通过海绵化miR-590-5p作为竞争性内源性RNA (ceRNA)，进而下调PDCD4，从而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。LHX1-DT作为RCC的独立预后生物标志物，IGF2BP2/LHX1-DT/miR-590-5p/PDCD4轴代表了RCC进展的新治疗靶点。本文于2025年6月发表于npj precision oncology（IF=8.0）上。

技术路线：

结果：

1）在RCC组织和细胞系中m6A水平下调

   最近的进展表明，m6甲基化参与了各种人类癌症的发生和发展。为了进一步研究这一点，我们评估了RCC组织和细胞系中的m6A水平。采用比色法检测RCC组织、邻近正常肾组织、正常肾小管上皮细胞（HK-2）、293 T细胞和RCC细胞系（Caki-1、786-O和ACHN）中m6A的总体水平。结果显示，RCC组织和细胞系的总体m6A水平明显低于邻近正常肾组织、HK-2细胞和293 T细胞（图1A， B）。接下来，我们检测了RCC组织和邻近正常肾组织中METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5等关键m6A调节因子的mRNA和蛋白表达。结果显示，RCC组织中METTL14的mRNA和蛋白表达明显低于邻近正常肾组织（图1C， D）。随后，我们评估了mettl14在HK-2细胞、293 T细胞和RCC细胞系中的表达。结果表明，METTL14mRNA在RCC细胞系中的表达明显低于HK-2细胞和293 T细胞（图1E）。western blot在RCC组织和细胞系中也观察到类似的结果（图1F，G）。同时，将METTL14过表达质粒转染到Caki-1细胞中（图1H）。结果表明，在Caki-1细胞中，METTL14过表达后m6A水平显著升高（图1I）。这些发现表明，RCC组织和细胞系中m6A水平的下调可能在调节RCC的发生和进展中起着至关重要的作用。

2）LHX1-DT是由m6A修饰调控的关键靶基因，与RCC患者预后不良有关

   最近的研究表明m6A修饰与lncRNA表达密切相关。几个研究小组发现m6A修饰可以通过影响lncRNA的稳定性来调节其表达。鉴于此，我们对3对RCC组织和邻近正常肾组织进行了m6A-mRNA和lncRNA表转录组微阵列分析。结果显示，m6A水平在2290个lncRNA中上调，在1660个lncRNA中下调。图2A列出了m6A水平上调前10位和下调前15位的lncRNA，其中m6A水平下调最明显的是LHX1-DT。两组的差异表达基因（DEGs）显示在火山图中（图2B）。同时，进行另一项微阵列分析，比较上述3对样品之间的lncRNA表达谱。结果显示，两组分别有1688个lncRNA上调，2931个lncRNA下调。图2C列出了上调和下调最多的15个lncRNA。值得注意的是，LHX1-DT在RCC组织中的表达明显低于配对相邻正常肾组织。火山图显示了两组之间的DEG（图2D）。随后，我们评估了RCC组织和细胞系中LHX1-DT的m6A水平。使用m6A抗体从RCC组织、邻近正常肾组织、HK-2细胞和RCC细胞系（Caki-1、786-O和ACHN）中拉下m6A修饰RNA，meRIP检测LHX1-DT的水平。结果显示，RCC组织和细胞系中LHX1-DT的m6A水平明显低于配对相邻的正常肾组织和HK-2细胞（图2E，F）。正如预期的那样，LHX1-DT在RCC组织和细胞系中的表达明显低于配对相邻的正常肾组织和HK-2细胞（图2G，H）。Kaplan-Meier分析进一步显示，在RCC患者中，高LHX1-DT表达与更好的OS相关（图2I）。这些发现提示LHX1-DT是一种受m6A修饰调控的独立预后因子，其表达与RCC患者预后良好相关。

3）LHX1-DT在体外和体内均能抑制RCC细胞的增殖和侵袭

   为了研究LHX1-DT在RCC中的生物学功能，我们进行了细胞增殖和侵袭实验。首先，用功能性LHX1-DT-cDNA和LHX1-DT-shRNA转染786-O和Caki-1细胞。qRT-PCR结果证实LHX1-DT表达得到有效调控（图3A，B）。细胞增殖实验结果显示，在786-O和Caki-1细胞中，过表达LHX1-DT可显著抑制细胞增殖，而敲低LHX1-DT可显著促进细胞增殖（图3C，D）。同样，在786-O和Caki-1细胞中进行的transwell侵袭试验也得到了类似的结果（图3E，F）。这些数据表明，LHX1-DT在体外抑制RCC细胞的增殖和侵袭。为了进一步探讨LHX1-DT在体内的作用，我们建立了原位异种移植小鼠模型来验证LHX1-DT的抗肿瘤作用。用荧光素酶标记Caki-1细胞并转染功能性LHX1-DT-cDNA。然后将这些细胞注射到裸鼠的肾包膜中。使用体内成像系统监测肿瘤大小。6周后，结果显示，与对照组相比，LHX1-DT过表达组的肿瘤生长、体积和重量均显著减少（图3G-I）。此外，与对照组相比，LHX1-DT过表达组Ki67染色降低（图3J）。qRT-PCR分析证实，过表达组LHX1-DT表达升高（图3K）。综上所述，上述数据表明LHX1-DT在体外和体内均能抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

4）LHX1-DT作为ceRNA吸收miR-590-5p

   为了探索LHX1-DT如何发挥其功能，我们使用在线工具lncATLAS预测了其亚细胞定位。结果表明LHX1-DT主要定位于细胞质中（图4A）。核细胞质分离实验证实了这一点（图4B）， FISH实验进一步验证了这一点（图4C）。最近的研究报道，细胞质lncRNA在人类癌症中既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为致癌基因，通常作为miRNA海绵发挥作用。因此，我们假设LHX1-DT可能通过海绵miRNA抑制RCC细胞的增殖和侵袭。为了验证这一点，我们使用特异性抗AGO2抗体进行了RIP实验，AGO2抗体是miRNA介导的mRNA翻译抑制和不稳定复合物的关键成分（图4D）。结果显示，与对照相比，内源性LHX1- DT AGO2的富集程度更高（图4E）。这些数据表明LHX1-DT可能作为ceRNA抑制RCC细胞的发育。然后，我们寻找可能与LHX1- DT结合的潜在miRNA。使用DIANA Tools，预测51个miRNA与LHX1-DT相互作用。通过GEO数据库（GSE12105）分析，其中40种miRNA在RCC组织中与邻近正常肾组织存在差异表达。在两个数据集中，miR-590-5p和miR-545-5p被鉴定为常见的miRNA（图4F）。qRT-PCR分析显示，与邻近正常肾组织相比，miR-590-5p在52对RCC组织中显著上调，而miR-545-5p无显著变化（图4G）。RIP实验证实AGO2可以与miR-590-5p相互作用（图4H）。因此，我们选择miR-590-5p进行进一步研究。为了探究LHX1-DT是否是ago2-miR-590-5p复合物的一部分，我们进行了AGO2实验。结果证实，LHX1-DT在miR-590-5p模拟物组中更富集（图4I）。接下来，我们发现在RCC组织和邻近正常肾组织中，miR-590-5p水平与LHX1-DT表达呈负相关（图4J）。LHX1-DT过表达导致miR-590-5p显著下调，而LHX1-DT沉默导致miR-590-5p上调（图4K，L）。采用野生型（LHX1-DT-WT）和突变型miR-590-5p结合位点（LHX1-DT-MUT）设计荧光素酶报告基因检测（图4M)。结果表明，野生型组的荧光素酶活性在miR-590-5p模拟物处理后显著降低，而突变组的荧光素酶活性保持不变，这表明LHX1-DT以序列特异性的方式靶向miR-590-5p（图4N，O）。此外，生物素偶联miR-590-5p成功拉下LHX1-DT的结合，而生物素偶联LHX1-DT在786-O和Caki-1细胞中成功拉下miR-590-5p（图4P）。随后，进行了一项拯救实验来研究miR-590-5p在RCC细胞增殖和侵袭中的作用。过表达miR-590-5p促进细胞增殖和侵袭，而上调LHX1-DT部分逆转了miR-590-5p对RCC细胞增殖和侵袭的促进作用（图4Q，R）。相反，沉默miR-590-5p抑制细胞增殖和侵袭，LHX1-DT沉默部分逆转了miR-590-5p对786-O和Caki-1细胞增殖和侵袭的抑制作用（图4S，T）。上述数据共同表明，LHX1-DT作为miR-590-5p的miRNA海绵，从而调节RCC的进展。

5）IGF2BP2结合LHX1-DT并以依赖m6A的方式调控其表达

   我们发现lncRNA可能是通过m6A修饰机制调控的靶标，尽管确切的潜在机制仍然很复杂。在此基础上，我们研究了LHX1-DT的m6A修饰。qRT-PCR结果显示，过表达METTL14显著增加了786-O和Caki-1细胞中m6A水平和LHX1-DT表达（图5A，B）。在RCC组织中也观察到METTL14和LHX1-DT水平呈正相关（图5C）。这些发现表明m6A修饰在LHX1-DT的下调中起作用。接下来，我们检测了METTL14操作后LHX1-DT的稳定性。结果显示，在actinomycin-D处理的786-O和Caki-1细胞中，METTL14的敲低显著降低了LHX1-DT的半衰期（图5D，E），表明METTL14通过调节LHX1-DT的稳定性来调节LHX1-DT的表达。因此，我们研究了能够识别甲基化LHX1-DT并调节其稳定性的潜在m6A读取器。最近的研究表明，IGF2BP家族可以识别m6A修饰并增加RNA稳定性。RIP实验显示LHX1-DT显著富集IGF2BP2，而不是IGF2BP1和IGF2BP3（图5F）。METTL14的缺失降低了IGF2BP2中LHX1-DT的富集（图5G），表明METTL14诱导的m6A修饰调节了IGF2BP2对甲基化LHX1-DT的识别。同时，抑制IGF2BP2降低了786- O和Caki-1细胞中LHX1-DT的半衰期（图5H，I），结果与METTL14敲除相似。这些数据表明IGF2BP2作为LHX1- DT的m6A读取器起作用。接下来，根据GEPIA2数据集，发现IGF2BP2表达在RCC中下调（图5J）。此外，为了研究SRAMP预测的潜在m6A修饰位点是否与LHX1-DT和IGF2BP2之间的相互作用有关，我们突变了所有预测的m6A修饰位点（图5K）。RIP实验结果表明，LHX1-DT与IGF2BP2之间的直接结合被它们的修饰位点突变所破坏（图5L）。m6A修饰位点突变后，METTL14或IGF2BP2介导的LHX1-DT调节功能受损（图5M）。为了确定哪个特定的m6A修饰位点负责稳定LHX1-DT，设计了三个LHX1-DT突变体（图5N）。荧光素酶报告基因分析显示，1号位点（UUGGACU）在调节LHX1-DT稳定性中起着关键作用（图5O）。综上所述，IGF2BP2以依赖m6A的方式结合LHX1-DT并增强其稳定性。

6）LHX1-DT通过靶向miR-590-5p/ PDCD4轴抑制RCC进展

   为了研究LHX1-DT/miR-590-5p轴在RCC进展中的机制，我们使用了三种在线分析工具并鉴定了11种可能成为miR-590-5p靶点的mRNA，包括PDCD4（图6A），一种已知的RCC中的肿瘤抑制因子。qRT-PCR结果显示，与邻近正常肾组织相比，RCC组织中PDCD4和BTG2的表达水平较低，其中PDCD4的表达下降更为明显（图6B）。使用52个配对的RCC样本，我们证实，与邻近的正常肾组织相比，RCC组织中的PDCD4表达显著降低（图6C）。KM分析结果显示，低PDCD4水平表明较差的OS（图6D）。此外，发现miR-590-5p水平与RCC组织中PDCD4表达呈负相关（图6E）。我们还观察到，在786-O和Caki-1细胞中，通过引入miR-590-5p模拟物或抑制剂，PDCD4的mRNA和蛋白水平分别下调或上调（图6F，G）。为了进一步验证miR-590-5p在PDCD4 3 '-UTR的预测结合位点，我们进行了荧光素酶报告基因实验（图6H）。结果显示，miR- 590-5模拟物处理后PDCD4-WT构建物的荧光素酶活性显著降低，而PDCD4-MUT构建物的活性保持不变（图6I，J）。在786-O和Caki-1细胞中，PDCD4过表达部分逆转了miR-590-5p模拟物对细胞增殖和侵袭的促进作用（图6K，L），而PDCD4敲低部分逆转了miR-590-5p抑制剂对细胞增殖和侵袭的抑制作用（图6M， N）。这些发现证实pdcd4是miR-590-5p的直接靶点。我们进一步发现RCC组织中PDCD4与LHX1- DT表达呈正相关（图6O）。结果表明，转染功能性LHX1-DT-cDNA或LHX1-DT-shRNA进入786-O和Caki-1细胞后，PDCD4蛋白和mRNA水平分别上调或下调（图6P，Q）。过表达LHX1-DT部分逆转了miR-590-5p模拟物对PDCD4表达的抑制作用（图6R，S），而敲低LHX1-DT部分逆转了miR-590-5p抑制剂在蛋白质和mRNA水平上对PDCD4表达的促进作用（图6T，U）。总之，这些数据表明LHX1-DT对RCC进展的抑制作用主要是通过miR-590-5p/PDCD4轴介导的。

7）PDCD4负责LHX1-DT介导的细胞增殖和侵袭抑制

   为了研究LHX1-DT是否以PDCD4依赖的方式抑制RCC进展，我们在786-O和Caki-1细胞中转染了功能性LHX1-DT-cDNA和PDCD4敲低载体。结果显示，PDCD4下调部分逆转了LHX1-DT过表达对RCC细胞增殖的抑制作用（图7A）。在786-O和Caki-1细胞中使用transwell侵袭实验获得了类似的结果（图7B）。相反，PDCD4的上调部分逆转了LHX1-DT敲低对RCC细胞增殖和侵袭的促进作用（图7C，D）。这些发现表明，LHX1-DT作为肿瘤抑制lncRNA，通过miR-590-5p/PDCD4信号通路抑制RCC细胞增殖和侵袭。

结论：

   我们的研究阐明了m6A修饰和lncRNA在调控RCC增殖和侵袭中的关键作用。我们证明m6Areader IGF2BP2可以通过识别特定的m6A修饰位点来增加LHX1-DT的稳定性，从而通过miR-590-5p/PDCD4轴抑制RCC的进展。这些发现突出了m6A修饰的LHX1-DT的功能意义，并为m6A甲基化对RCC的表观遗传调控提供了新的见解。

参考文献：

Zhu C, Li R, You X, Xu J, Wang J, Dong D, Chen X, Wang K. m6A reader IGF2BP2-stabilized lncRNA LHX1-DT inhibits renal cell carcinoma (RCC) cell proliferation and invasion by sponging miR-590-5p. NPJ Precis Oncol. 2025 Jun 17;9(1):193. doi: 10.1038/s41698-025-00958-x.