肾移植患者的福音 最新研究解析了同种异体T细胞耐受机制

   诱导稳定的移植耐受性仍然是免疫学领域的一大挑战。此前，作者通过预先向原位抗原呈递细胞（APC）递送同种异体抗原，在非人灵长类动物中诱导了对同种异基因胰岛的耐受性。本研究中，结合供体来源的MHC-I肽加载的MHC-II四聚体的CyTOF表型分析揭示了耐受受者脾脏中同种特异性CD4⁺T细胞簇的积累。Areg⁺Tr1调节细胞和终末期耗竭的EGFRhi T（Tex）细胞代表了主要的同种特异性亚群。轨迹分析显示，抗原经历效应记忆T细胞分化为抑制性的Areg⁺Tr1和EGFR⁺TOX⁺Nur77⁺TCF-1^-Tex亚群。细胞间通讯显示，耗竭的效应记忆T细胞通过Areg-EGFR轴与同种特异性Tr1细胞相互作用。基因沉默研究表明，Tr1细胞利用Areg-EGFR信号通过Nur77依赖性途径驱动CD4⁺ T细胞的代谢抑制和表观遗传重编程。这些发现将脾脏中的Areg⁺Tr1细胞-EGFR⁺Teff细胞轴指向为外周移植耐受中的关键免疫调节通路。本文于2026年1月发表在《Science Advances》IF:12.5。

技术路线：

主要实验结果：

1、耐受性与脾脏中特定的CD4⁺T细胞簇相关

   通过CyTOF鉴定26个表型独特的CD4⁺ T细胞簇；将这些集群注释为naïve、效应记忆T细胞（Tem）、Treg或耗竭CD4⁺ T细胞。调节性和耗竭样T细胞簇在耐受性非人灵长类动物（NHPs）中显著富集，Tr1特征簇c1在耐受性NHPs的PBLs中富集3.4倍，在脾脏中富集6.5倍。Treg特征簇c9和c20在耐受性NHPs中显著增加，耗竭样簇c10、c11、c18和c22在耐受性NHPs中更普遍，Tem特征簇在非耐受性NHPs中富集。

图1 猕猴胰岛移植受者26种不同CD4⁺ T细胞群的表型特征

2、耐受NHP脾脏中同种异体CD4⁺ T细胞富集

   在作者早期的研究中，观察到耐受性NHPs的外周血淋巴细胞中异种特异性T细胞数量较低。这一发现促使作者思考：耐受性方案是清除了这些细胞，还是仅仅将它们重新定位到了次级淋巴器官。鉴于静脉注射的抗原决定簇主要分布于脾脏区域，所以作者针对该部位进行研究，以检测其中是否存在异体特异性CD4⁺T细胞及其异质性。为此，使用MHC II四聚体II-Tet pMHC-I⁺技术在耐受队列C的NHPs中进行检测，发现脾脏CD4⁺ T细胞中同种异体特异性细胞的比例高于外周血淋巴细胞，这一模式在非耐受队列B和D中未被观察到（图2A）。鉴定16个表型独特的同种异体CD4⁺ T细胞亚群，在耐受性NHPs中：调节性同种异体CD4⁺ T细胞簇的脾脏中富集；同种异体Tr1簇c4在脾脏中富集11.9倍，在PBLs中富集4.1倍；同种异体调节性T细胞簇c5在脾脏中富集27.8倍；同种异体Tr1簇c15在脾脏和PBLs中均富集约7倍；同种异体耗竭T细胞簇在耐受性NHPs中富集；同种异体Tex特征细胞簇c9在PBLs中富集33倍，在脾脏中富集3.7倍，而c14则6倍富集于脾脏（图2B-E）。相反，记忆特征的簇则在耐受NHPs中下降。此外还发现耐受性NHPs的脾脏CD4⁺ T细胞显示多功能性受损（图2F）。

图2 受者脾脏中同种异体调节性CD4⁺ T和耗竭性CD4⁺ T细胞富集

3、耐受脾脏中的同种异体特异性Tr1细胞通过Areg-EGFR轴与Tex和Tem亚群互作

   Areg⁺Tr1和EGFR⁺Teff细胞在耐受性NHPs的脾脏中增加，提示存在调节细胞与效应细胞的相互作用。作者利用CellChat算法进行的细胞间相互作用揭示了一个Areg-EGFR轴主导的连接Tr1与Tex/Tem细胞簇，并在耐受性NHP中形成密集的双向信号网络。Tr1细胞簇c2和c4显示最强的 outgoing信号，靶向Tex和Teff样簇。

图3 耐受脾脏中的同种异体特异性Tr1细胞通过Areg-EGFR信号通路与Tex和Tem亚群互作

4、耐受性脾脏中同种异体Tr1和Tex细胞的发育命运与Temra细胞相关

   使用Slingshot伪时间分析追踪同种异体CD4⁺ T细胞的发育轨迹，鉴定四个命运：Tex样、Tr1样、Treg样和记忆/效应样表型。谱系4和8轨迹显示分别向GrnzB^hi Areg⁺Tr1样和OX40^hi CCR ^hiAreg⁺ Tr1样细胞成熟分化；谱系1 2 5向不同Tex样细胞成熟。T细胞耗竭轨迹定义为TOX、TIGIT和TIM-3的渐进性上调和TCF-1的丢失；总之，伪时序分析揭示在耐受过程中，抗原经验丰富的CD4⁺Temra细胞向调节性和耗竭状态的转变。

按照细胞表型和耗竭得分进行UMAP分析Tex样、Tr1样细胞簇。单细胞轨迹分析显示Tr1细胞出现在发育早期，终末耗竭Tex细胞出现在后期，表明Tr1细胞先于并可能影响Teff的耗竭轨迹，这表明在耐受巩固过程中，早期的Tr1细胞分化主动塑造了耗竭程序。

图4 耐受NHPs的同种特异性脾CD4⁺ T细胞获得发育成熟的调节性和耗竭性的命运

5、Areg⁺Tr1细胞是耐受性NHPs脾脏中主要的同种异体特异性调节亚群

   同种异体Tr1细胞在耐受性NHPs的脾脏中显著富集，因而进一步分析它们的表型异质性和命运轨迹。鉴定9个表型独特的Tr1亚群；耐受性NHPs中，Tr1簇c3、c4、c5和c7在脾脏中富集，而c4在PBLs中富集；部分细胞簇缺乏典型标志物，提升其可能存在功能多样性；Areg⁺EGFR⁺ Tr1簇c4在耐受性NHPs的脾脏中富集6倍，在PBLs中富集21倍；轨迹推断定义了四条分化路径，在耐受性NHPs中终端伪时间积累主要积累c3和c4，以Areg、Helios、Tbet、CD69和HLA-DR表达为特征。这些发现确认了脾脏是移植耐受期间Areg⁺Tr1细胞扩增和功能编程的关键场所。

图5 耐受NHPs脾脏中同种异体特异性Areg⁺ Tr1细胞富集

6、耐受性NHPs脾脏中积累EGFR⁺终末耗竭型同种异体特异性CD4⁺ T细胞

   在证实了耐受性NHPs脾脏中表型成熟异种特异性Areg⁺ Tr1细胞的积累后，作者进一步探究了耐受性是否同样与脾脏中异种特异性耗竭样CD4⁺T细胞的积累相关。鉴于脾脏在外周耐受中的作用以及慢性抗原暴露与T细胞耗竭之间的关联，作者分析了NHPs脾脏和PBLs中的PD-1⁺CD4⁺Tex细胞。结果发现同种异体Tex细胞在耐受性NHPs的脾脏中3倍富集（vs PBLs）；鉴定10个表型独特的同种异体CD4⁺ Tex细胞簇；终末耗竭PD-1^hi TCF-1^-Tem样细胞簇c1和c4在耐受性NHPs的脾脏中显著富集；轨迹分析显示从记忆样亚群向终末耗竭Tex簇的分化路径；耐受性NHPs显示更高的伪时间分数，>65%的同种异体Tex细胞占据终末耗竭状态。综上所述，这些数据表明，耐受状态下的脾脏Tex细胞反映了在癌症和慢性病毒感染中观察到的保守耗竭轨迹，这支持了它们在免疫抑制和持久移植耐受中的作用。

图6 耐受性NHPs脾脏中同种异体EGFR⁺ Tex细胞的富集

7、Areg-EGFR轴介导Tr1驱动的CD4⁺ T细胞抑制与代谢调控

   在前面的结果里，在耐受性NHPs中，观察到脾脏内Areg⁺Tr1细胞显著增加，同时伴有表达EGFR的Tex/eff细胞增多，且Tr1、Tex与Teff细胞间存在强烈的细胞间相互作用（图3）。基于这些发现，作者进一步探究Areg在Tr1细胞介导的免疫调节中的机制作用。具体而言，作者验证了Areg是否促进Tr1细胞分化并诱导T细胞耗竭。结果发现重组Areg处理使CD4⁺ T细胞中Areg与EGFR共表达增加超过2倍，同时耗竭相关转录因子Nur77和TOX表达上调。该处理还使Tr1细胞扩增3至6倍，表明Areg具有促进Tr1细胞分化的作用。此外，还发现Areg处理抑制组蛋白乙酰化和代谢基因表达。

   为评估Tr1细胞来源的Areg的功能贡献，从离体ADL刺激培养体系中分选出Tr1细胞，静置过夜后，用Areg特异性siRNA处理72小时或不做处理（图7A）。将这些细胞被动转移至单向混合淋巴细胞反应体系，同时向反应性T细胞（respT细胞）转染Nur77 siRNA或不做转染。结果显示Tr1细胞显著抑制respT细胞增殖、耗氧率（OCR）并下调关键代谢基因表达、组蛋白乙酰化，但Tr1细胞中Areg沉默或respT细胞中Nur77敲低可使增殖、代谢、乙酰化恢复，表明Tr1来源的Areg通过Nur77依赖机制抑制CD4⁺ T细胞增殖、代谢调控以及组蛋白乙酰化。

   为进一步明确EGFR信号通路是否对Tr1细胞介导的抑制效应及耗竭状态诱导具有关键作用，采用耐受性NHPs的脾细胞进行了体外互补实验（图7A）。实验通过混合淋巴细胞反应，将纯化的Tr1细胞与反应性CD4⁺ T细胞共培养，设置以下变量：反应性细胞是否接受EGFR中和抗体处理，以及是否使用Areg基因沉默的Tr1细胞。在两项独立实验中，EGFR信号阻断或Areg基因敲低均能持续减弱Tr1介导的抑制作用，具体表现为：TNF-α和IFN-γ分泌水平升高（图7E），CD69与穿孔素表达增加，同时反应性效应T细胞中TOX⁺Nur77⁺TIGIT⁺耗竭标志物的诱导受到抑制。表明Areg-EGFR信号通路是Tr1驱动免疫抑制及效应T细胞耗竭的内在必要条件。

   综上，确立Areg⁺Tr1-EGFR⁺CD4⁺效应T细胞轴作为Tr1介导免疫抑制与代谢调控的关键机制，并揭示了其在移植耐受中的重要作用。

图7 Tr1对Teff细胞的功能抑制和耗竭需要完整的Areg-EGFR信号

参考文献：

Amar Singh et al., Allospecific splenic Tr1 cells drive effector T cell exhaustion through up-regulated Areg-EGFR signaling to promote transplant tolerance. Sci. Adv. 12, eaea0567(2026). DOI:10.1126/sciadv.aea0567