癌症相关成纤维细胞通过METTL1介导的NET1 m7G修饰促进非小细胞肺癌细胞对奥希替尼的耐药性

   奥希替尼耐药仍然是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗面临的一项重大挑战。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中最丰富的基质细胞，然而其在NSCLC奥希替尼耐药中的作用尚未完全阐明。本研究发现，CAFs通过提升RNA m7G修饰促进NSCLC细胞的奥希替尼耐药。NSCLC细胞中的METTL1介导了CAFs对m7G修饰的影响，且METTL1与NSCLC的进展及不良预后相关。进一步研究表明，CAFs通过分泌HMGB1上调NSCLC细胞中METTL1的表达。通过MeRIP-seq和RNA-seq分析，NET1被鉴定为METTL1的靶点，NET1的m7G修饰增强提高了其表达水平并激活了下游AKT/NF-κB通路。重要的是，通过敲低METTL1来降低m7G修饰，可显著减弱CAFs在体内外对奥希替尼耐药的促进作用。我们的研究揭示了CAFs通过调节m7G修饰赋予NSCLC细胞奥希替尼耐药性的新机制。这些发现强调了m7G修饰在癌细胞与TME通讯中的重要性，并为通过靶向m7G修饰寻找克服耐药性的新型治疗策略奠定了基础。本文于2026年2月发表于Cell Death and Disease（IF=9.6）上。

技术路线：

结果：

1）CAFs增强NSCLC细胞对奥希替尼的耐药性

   我们从NSCLC患者的样本中分离出CAFs和NFs，并选择EGFR突变的NSCLC细胞系PC9（EGFR del19）和H1975（L858R/T790M）来检测奥希替尼的治疗效果。将NSCLC细胞培养在CAFs条件培养基（CAF-CM）或NFs条件培养基（NF-CM）中，随后用奥希替尼处理。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力。图1A–C显示，CAFs和NFs均降低了NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性，且CAFs的作用更为显著。通过集落形成实验进一步测定CAFs对细胞生长的影响，结果显示CAFs不仅增强了未处理细胞的集落形成能力，也增强了经奥希替尼处理后的细胞集落形成能力（图1D–G）。我们接下来研究了CAFs对凋亡诱导的影响。如图1H–K所示，CAFs不影响未处理细胞的凋亡水平，但显著降低了奥希替尼处理组的细胞凋亡水平。随后我们检测了凋亡相关基因，发现CAFs抑制了Caspase-3的激活，并上调了Survivin和Bcl-2的表达（图1L）。我们进一步评估了CAFs对细胞干性的影响。CAFs通过上调干性相关基因SOX2、OCT4和NANOG促进了NSCLC细胞的干性（图1M）。综上所述，这些结果表明CAFs通过减少细胞凋亡和促进细胞干性，增强了NSCLC细胞对奥希替尼的耐药性。

2）CAFs增加NSCLC细胞的m7G修饰

   越来越多的证据表明，异常的m7G修饰参与肿瘤发生和肿瘤进展，然而，CAFs对癌细胞中m7G修饰的影响尚未阐明。为了评价CAFs在癌细胞m7G修饰中的作用，我们将NSCLC细胞培养在CAFs-CM中，用Dot Blot法检测癌细胞中m7G修饰的情况。图2A、B显示，NFs和CAFs均能提高NSCLC细胞中m7G修饰水平，但CAFs的作用更强。基于这一发现，我们接下来对在CAF-CM中培养的NSCLC细胞进行MeRIP-seq以检测m7G修饰。MeRIP-seq结果还表明，CAFs增加了NSCLC细胞中的m7G修饰水平，特别是CDS区和3'UTR区m7G修饰水平增加，而5'UTR区m7G修饰水平降低（图2C，D）。鉴于METTL1/WDR4复合体在mRNA上安装了m7G修饰，我们专注于METTL1/WDR4复合体。我们首先比较了METTL1在肺癌细胞（PC9和H1975细胞）和正常人肺支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）中的表达水平。图2E、F显示肺癌细胞在mRNA和蛋白水平上均表达较高水平的METTL1。重要的是，与配对的非肿瘤组织相比，METTL1在肿瘤组织中也上调（图2G，H）。然后我们研究了CAFs是否影响肺癌细胞中METTL1的表达，发现CAFs上调了METTL1（图2I，J）。此外，我们评估了肺癌细胞中的WDR4水平。与METTL1类似，与正常肺支气管上皮细胞相比，WDR4在NSCLC细胞中的表达更高，并被CAFs上调（图2K，L）。这些数据表明，CAFs增加了NSCLC细胞中m7G的修饰，并且CAFs可以调节METTL1和WDR4。

3）METTL1介导CAFs对NSCLC细胞m7G修饰和奥希替尼耐药的影响

   由于METTL1是一种甲基转移酶，而WDR4是一种稳定分子，因此我们关注了METTL1在CAFs对m7G修饰的影响中的作用。通过过表达或敲低METTL1在NSCLC细胞中的表达（图3A，B）， Dot Blot检测m7G修饰。如图3C所示，METTL1敲低降低了m7G修饰水平，而METTL1过表达增加了m7G修饰水平。为了确定METTL1是否与CAFs对m7G修饰的影响有关，我们在NSCLC细胞中敲低METTL1，并在CAF-CM中培养细胞。Dot Blot实验显示，CAFs对m7G修饰的促进作用减弱，提示METTL1介导的CAFs对m7G修饰的作用（图3D）。接下来，我们研究了METTL1在CAFs对NSCLC细胞奥希替尼耐药作用中的作用。我们首先检测了METTL1在奥希替尼治疗下对细胞生长的影响，发现METTL1缺失显著增强了NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性（图3E-G）。然后将METTL1敲低的NSCLC细胞培养在CAF-CM中，并用奥希替尼处理。有趣的是，METTL1敲低显著减弱了CAFs对奥希替尼耐药的刺激作用（图3H-J），表明CAFs通过METTL1介导的m7G修饰促进了NSCLC细胞对奥希替尼的耐药。此外，我们评估了METTL1在奥希替尼处理的NSCLC细胞集落形成和凋亡诱导中的作用。如图3K-R所示，降低METTL1显著减少菌落数量，增加细胞凋亡率。TCGA数据库分析表明，METTL1在肺癌患者中比健康人高表达，通过配对肿瘤和正常邻近组织的分析进一步支持了这一点（图3S，T）。此外，高水平的METTL1与低生存率相关（图3U）。此外，METTL1水平与肺癌的病理分期相关（图3V）。综上所述，这些数据表明METTL1介导的CAFs对NSCLC细胞m7G修饰和奥希替尼耐药的影响，重要的是，METTL1参与了肺癌的进展。

4）CAFs通过分泌HMGB1提高NSCLC细胞中METTL1和m7G修饰水平

   CAFs通过分泌生长因子和细胞因子等蛋白质调节癌细胞功能。在我们之前的研究中，我们通过RNA-seq比较了CAFs和NFs中差异表达的基因，发现HMGB1在CAFs中高表达。为了阐明HMGB1在CAFs对NSCLC细胞m7G修饰作用中的潜在作用，我们首先通过ELISA法比较细胞释放的HMGB1水平，发现CAFs分泌的HMGB1水平明显高于肺癌细胞分泌的HMGB1水平（图4A）。然后，我们确定了源自CAFs的HMGB1对肺癌细胞中METTL1表达的影响。如图4B、C所示，CAF-CM和重组人HMGB1均显著提高了METTL1的表达，而在CAF-CM中加入HMGB1中和抗体后，CAFs对METTL1表达的增强作用减弱。利用重组人HMGB1和HMGB1中和抗体，研究了HMGB1对肺癌细胞m7G修饰的影响。图4D显示HMGB1介导了CAFs对m7G修饰水平的影响。这些结果表明，CAFs通过HMGB1分泌提高了NSCLC细胞中METTL1和m7G修饰水平。

5）CAFs通过METTL1增加NSCLC细胞中m7G修饰水平和NET1表达

   基于上述发现，CAFs可提高NSCLC细胞的m7G修饰水平，我们下一步研究CAFs调控哪些基因的m7G修饰。因此我们对CAFs处理的NSCLC细胞进行了RNA测序，并分析了差异表达基因。RNA-seq数据显示，上调基因1721个，下调基因2256个（图5A，B）。我们进一步将RNA-seq数据与MeRIP-seq数据进行关联分析，发现有1124个高甲基化基因，其中630个基因表达上调（hyper-up）， 494个基因表达下调（hyper-down）；同时，有1340个低甲基化基因，其中475个基因表达上调（低上调），865个基因表达下调（低下调）（图5C）。由于m7G修饰可能会增加RNA的稳定性和表达，因此我们专门筛选了在癌症中具有促进作用的高表达基因。在这些基因中，NET1被选为候选基因之一。我们首先在m7GHub网站上分析了NET1中预测的m7G修饰位点，发现NET1中有11个预测的m7G修饰位点（图5D）。随后，我们在ENCORI网站上探索了METTL1调控NET1的可能性，发现METTL1可能与NET1 mRNA结合（图5E）。基于以上分析，我们选择NET1进行进一步的研究。为了验证测序结果，我们在CAF-CM中培养NSCLC细胞，分别用MeRIP-qPCR和qPCR检测m7G修饰水平和NET1表达水平。如图5F、G和图5H、I所示，m7G修饰水平和NET1 mRNA水平均上调，与测序结果一致。此外，Western blot检测显示，CAFs也增加了NET1的蛋白水平（图5J）。鉴于NSCLC细胞的m7G修饰是由METTL1催化的，我们研究了NET1的m7G修饰是否也被METTL1调节。利用RIP-qPCR检测METTL1与NET1转录物之间的直接相互作用。通过应用特异性抗METTL1抗体，我们发现CAFs显著增加了NET1 mRNA的表达；然而，在METTL1缺失的细胞中，NET1 mRNA的富集程度有所降低（图5K）。为了进一步证实METTL1对NET1的m7G修饰，我们在肺癌细胞中过表达METTL1，通过MeRIP-qPCR检测NET1的m7G修饰。图5L显示，NET1的m7G修饰明显升高。同时，当METTL1被敲除后，CAFs对m7G修饰的增强作用被取消（图5M），表明METTL1介导了CAFs对NET1的m7G修饰。由于m7G修饰影响RNA稳定性和翻译，我们探索METTL1是否负责这一过程。我们发现METTL1增加了NET1 mRNA的稳定性（图5N-Q）。与此发现一致，METTL1也在转录和翻译水平上刺激了NET1的表达（图5R-T）。值得注意的是，当METTL1表达减少时，CAFs对NET1表达的影响减弱（图5U V）。综上所述，我们的研究结果表明，CAFs通过METTL1增加了NSCLC细胞中m7G修饰水平和NET1的表达。

6）NET1通过AKT/NF-κB通路刺激NSCLC细胞对奥希替尼耐药

   接下来，我们探讨了NET1在CAFs对NSCLC细胞奥希替尼耐药作用中的作用。由于CAFs上调了NET1的表达，我们通过RNAi降低了肺癌细胞中NET1的表达，发现NET1的缺失增加了NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性（图6A-C）。我们在NSCLC细胞中进一步敲低或过表达NET1，然后在CAF-CM中培养细胞，并用奥希替尼处理细胞。图6D-G显示，NET1缺失减弱，而NET1过表达刺激CAFs增强NSCLC细胞对奥希替尼的耐药。通过对TCGA数据库的分析，我们发现NET1在总肺癌组织和配对肺癌组织中均表达上调，且NET1水平高与预后差相关。此外，NET1水平与肺癌分期相关（图6H-K）。为了阐明CAFs对NSCLC细胞作用的信号通路，我们对我们的RNA-seq数据进行了KEGG通路分析。图6L表明，CAFs激活了PI3K-AKT通路。进一步的细胞实验表明，CAFs升高了p-AKT和p-p65水平，同时，总AKT和p65水平保持不变（图6M）。由于对奥希替尼的耐药机制之一是信号通路的激活，包括PI3K-AKT通路，我们研究AKT/NF-κB通路是否参与了CAFs对NSCLC细胞奥希替尼耐药的影响。用选择性AKT抑制剂perifosine或NF-κB抑制剂JSH23预处理肺癌细胞。如图6N和图6所示，抑制AKT/NF-κB通路可显著减轻CAFs对NSCLC细胞奥希替尼耐药的增强作用。此外，我们在NSCLC细胞中调控NET1的表达，检测AKT/NF-κB通路，发现NET1介导的CAFs对AKT/NF-κB通路的影响（图6P）。综上所述，这些数据表明，NET1通过AKT/ NF-κB途径参与了CAFs对NSCLC细胞奥希替尼耐药的刺激。

7）抑制m7G修饰可减弱CAFs对体内肺癌生长的影响

   为了评估m7G修饰在体内肺癌细胞生长中的作用，我们利用慢病毒建立了稳定的METTL1敲低肺癌细胞系。通过观察GFP荧光和Western blot检测慢病毒感染和METTL1沉默的效率（图7A，B）。有趣的是，我们发现METTL1敲低抑制肺癌细胞生长（图7C，D）。接下来，我们试图阐明m7G修饰对肺癌细胞体内生长的影响。将小鼠分为4组，分别为PC9细胞组、PC9细胞+奥希替尼组、PC9细胞+ CAFs +奥希替尼组、PC9-METTL1-KD细胞+ CAFs +奥希替尼组。以肿瘤体积测定肿瘤生长情况。如图7E-I所示，虽然CAFs显著刺激肿瘤生长，但METTL1-KD显著减轻了CAFs的刺激作用。然后我们检测了肿瘤组织中m7G的修饰。Dot Blot实验显示，CAFs增加了m7G修饰水平，但在PC9- METTL1-KD细胞中，CAFs对m7G修饰的增加作用被取消（图7J，K）。此外，我们通过检查肿瘤组织来探索其潜在机制。免疫组织化学分析显示，CAFs上调了METTL1和NET1的表达，METTL1-KD下调了NET1的表达（图7L）。Western blot检测显示，CAFs上调了METTL1和NET1的表达，激活了AKT/NF-κB通路（图7M）。这些结果与我们的体外研究结果一致，表明CAFs通过METTL1介导的m7G修饰NET1和激活AKT/NF-κB通路促进肿瘤生长。

结论：

   CAFs通过 m7G 修饰依赖机制促进NSCLC细胞对奥希替尼的耐药性，而 METTL1 介导了 m7G 修饰的调节。进一步的研究表明，METTL1 提高了 m7G 修饰水平和 NET1 的表达，NET1 激活 AKT/NF-κB 通路，从而促进奥希替尼耐药性。这些发现强调了 m7G 修饰在癌细胞与肿瘤微环境之间交流中的重要性，表明靶向 CAF-METTL1-NET1 m7G 修饰-AKT/NF-κB 轴可能是克服奥希替尼耐药性的新策略。

参考文献：

Qian Y, Gong Z, Jia Y, Zhang Q, Cao L, Li B, Zhang J, Wang M, Wu X, Xu K. Cancer-associated fibroblasts promote osimertinib resistance in non-small cell lung cancer cells via METTL1-mediated NET1 m7G modification. Cell Death Dis. 2026 Feb 21;17(1):248. doi: 10.1038/s41419-026-08505-7.