ESRP1/circPHGDH/miR-149/RAP1B正反馈环路促进前列腺癌细胞的恶性生物学行为及糖酵解过程
环状RNA在前列腺癌发病中的作用机制尚未明确，本研究探究circPHGDH在前列腺癌中的功能及调控机制，通过多种细胞和分子实验评估细胞行为、解析分子通路并检测ESRP1乳酸化修饰。研究发现，circPHGDH在前列腺癌组织和细胞中高表达，敲低该基因可显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化及糖酵解。分子层面，circPHGDH作为miR-149的分子海绵，调控其靶基因RAP1B；剪接因子ESRP1促进circPHGDH 的生物合成，而糖酵解产物乳酸通过促进ESRP1的K43位点乳酸化维持其稳定性，circPHGDH 敲低则会抑制该修饰。体内实验证实，circPHGDH通过miR-149/RAP1B 轴促进肿瘤生长和转移，敲低后可显著抑制肿瘤进展。综上，乳酸化修饰的ESRP1/circPHGDH/miR-149/RAP1B正反馈调控轴推动前列腺癌进展，该研究为前列腺癌发病机制提供新见解，也为其治疗提供了潜在靶向位点。这篇文章于2026年2月27日发表于《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》期刊上，IF:12.9。
研究技术路线：
主要实验结果：
1、前列腺癌中circPHGDH的鉴定
为筛选参与前列腺癌进展的关键环状 RNA，我们首先进行了芯片分析，结果显示高分级与低分级前列腺癌组织中存在多种差异表达的环状 RNA（图 1a、b）。在这些差异表达的环状 RNA 中，circ_0000121的功能尚未明确，因此我们将其选为后续研究对象，并将其命名为 circPHGDH，其基因结构如图 1c 所示。该环状 RNA 由 PHGDH 基因的两个外显子反向剪接形成，定位于人 1 号染色体 120285606-120286575 位点，且其反向剪接连接位点已通过桑格测序验证。
随后，我们对circPHGDH 的分子特征进行了验证。作为典型的环状 RNA，经核糖核酸酶 R（RNase R）处理后，线性 PHGDH 信使 RNA 发生降解，而 circPHGDH 的表达水平几乎未受影响（图 1d）。actinomycinD 处理实验显示，线性 PHGDH 信使 RNA 的半衰期约为 4 小时，而 circPHGDH 的半衰期超过 12 小时（图 1e）。此外，荧光定量 PCR 及电泳结果表明，circPHGDH 可从互补 DNA 中扩增得到，而无法从基因组 DNA 中扩增（图 1f）。
亚细胞分离实验和荧光原位杂交实验结果显示，circPHGDH 主要定位于 22Rv1 和 VCaP 前列腺癌细胞的细胞质中（图1g、h）。以上结果共同证实，circPHGDH 是前列腺癌细胞中一种结构稳定的经典环状 RNA。
图1 前列腺癌细胞中circPHGDH的鉴定
2、circPHGDH促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化及糖酵解
为探究circPHGDH在前列腺癌中的生物学功能，我们首先检测了其在临床样本中的表达水平，荧光定量 PCR 结果显示，与癌旁正常组织相比，前列腺癌组织中 circPHGDH 的表达显著上调（图 2a）。我们将 51 例前列腺癌患者按 circPHGDH 表达水平分为高表达组和低表达组，临床特征相关性分析显示，两组患者的年龄、肿瘤数目无显著差异，而 circPHGDH 高表达与肿瘤体积增大、T 分期升高及远处转移显著相关，提示 circPHGDH 可能是调控前列腺癌进展的关键分子。
同时，与永生化正常前列腺上皮细胞系 WPMY1 相比，多种前列腺癌细胞系中 circPHGDH 的表达均显著升高（图 2b）。其中 22Rv1 和 VCaP 细胞中 circPHGDH 的内源性表达水平相对较高，因此我们选择这两种细胞系开展后续实验。我们在上述细胞中分别敲低和过表达 circPHGDH，荧光定量 PCR 验证了转染效率，结果显示，sh-circPHGDH可显著下调 circPHGDH表达，而oe-circPHGDH 可显著上调其表达（图 2c）。
功能实验结果显示，敲低circPHGDH 可显著抑制 22Rv1 和 VCaP 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而过表达 circPHGDH 则可促进这些恶性生物学行为（图 2d-f）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，敲低 circPHGDH 可上调上皮标志物 E - 钙粘蛋白的表达，下调间质标志物 N - 钙粘蛋白的表达；而过表达 circPHGDH 则呈现出相反的表达趋势（图 2g）。此外，细胞能量代谢检测实验显示，敲低 circPHGDH 可降低细胞的细胞外酸化率、提高耗氧率，而过表达 circPHGDH 则可提高细胞外酸化率、降低耗氧率（图 2h、i）。以上结果表明，circPHGDH 作为癌基因，可通过促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化及糖酵解过程，推动前列腺癌的发生发展。
图 2 circPHGDH促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化及糖酵解
3、circPHGDH在前列腺癌细胞中充当miR-149的分子海绵
为阐明circPHGDH 发挥作用的分子机制，我们通过双荧光素酶报告基因实验筛选其潜在靶向的微小RNA，最终选择 miR-149 开展后续研究，因其对荧光素酶活性的抑制作用最为显著（图 3a）。生物信息学分析预测，circPHGDH 序列中存在 miR-149 的潜在结合位点（图 3b）。双荧光素酶报告基因实验验证显示，过表达 miR-149 可显著降低含野生型 circPHGDH 序列的报告基因的荧光素酶活性，而对突变型报告基因无显著影响（图 3c）。RNA 下拉实验进一步证实了二者的直接相互作用，生物素标记的 miR-149 探针可特异性富集 circPHGDH（图 3d）。
此外，敲低circPHGDH 可显著上调 miR-149 的表达，而过表达 circPHGDH 则可显著下调 miR-149 的表达（图 3e）。临床样本检测结果显示，前列腺癌组织中 miR-149 的表达水平显著低于癌旁正常组织（图 3f），且 Pearson 相关性分析显示，前列腺癌组织中 circPHGDH 的表达与 miR-149 的表达呈显著负相关（r=-0.631，P<0.001；图 3g）。细胞系检测结果显示，与 WPMY1 细胞相比，前列腺癌细胞系中 miR-149 的表达显著降低（图 3h）。荧光原位杂交实验结果显示，circPHGDH 与 miR-149 共定位于前列腺癌细胞的细胞质中（图 3i）。以上结果证实，circPHGDH在前列腺癌细胞中可充当miR-149 的分子海绵，通过吸附miR-149 调控其表达。
图 3 circPHGDH 在前列腺癌细胞中充当miR-149的分子海绵
4、下调miR-149可逆转敲低circPHGDH对前列腺癌细胞生物学行为的抑制作用
为验证circPHGDH是否通过调控 miR-149 发挥生物学功能，我们开展了挽救实验。实验结果显示，转染 miR-149 模拟物可显著上调 miR-149 的表达，转染 miR-149 抑制剂则可显著下调其表达，证实了转染效率。重要的是，miR-149 抑制剂可逆转敲低 circPHGDH 对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用；同时，敲低 circPHGDH介导的 E - 钙粘蛋白上调和 N - 钙粘蛋白下调效应，也可被 miR-149 抑制剂逆转。此外，miR-149 抑制剂还可逆转敲低 circPHGDH 导致的细胞外酸化率降低和耗氧率升高。相关性分析显示，22Rv1 和 VCaP 细胞中 circPHGDH 与 miR-149 的表达呈显著负相关。以上结果表明，敲低 circPHGDH 通过吸附 miR-149，抑制前列腺癌细胞的恶性生物学行为。
5、miR-149在前列腺癌细胞中靶向调控RAP1
为进一步阐明circPHGDH/miR-149 轴发挥作用的下游分子机制，我们通过 miRDB、starBase 和 TargetScan 数据库预测 miR-149 的下游靶基因，共得到 153 个共同候选靶基因（图 4a）。京都基因与基因组百科全书富集分析显示，这些靶基因富集于包括 Rap1信号通路在内的多条信号通路（图 4b）。已有研究表明，Rap1 信号通路的激活可促进前列腺癌细胞的迁移、侵袭及肿瘤发生和转移，因此我们选择该通路中的关键分子 RAP1B 开展后续研究。
生物信息学分析预测了miR-149 与 RAP1B 的 3' 非编码区的潜在结合位点（图 4c）。双荧光素酶报告基因实验显示，过表达 miR-149 可显著降低含野生型 RAP1B 3' 非编码区的报告基因的荧光素酶活性，而对突变型报告基因无显著影响（图 4d）。RNA 下拉实验证实了二者的直接相互作用，生物素标记的 miR-149 探针可特异性富集 RAP1B 信使 RNA（图 4e）。
上下游调控关系验证显示，敲低circPHGDH 可显著降低 RAP1B 的信使 RNA 和蛋白表达水平，而下调 miR-149 则可逆转该下调效应（图 4f、g）。临床样本检测结果显示，前列腺癌组织中 RAP1B 的表达显著高于癌旁正常组织（图 4h），且 Pearson 相关性分析显示，前列腺癌组织中 RAP1B 的表达与 miR-149 的表达呈显著负相关（r=-0.629，P<0.001；图 4i）。细胞系检测结果显示，与 WPMY1 细胞相比，前列腺癌细胞系中RAP1B 的信使 RNA 和蛋白表达均显著上调（图 4j、k）。以上结果证实，RAP1B 是 miR-149 在前列腺癌细胞中的直接靶基因。
图 4 miR-149在前列腺癌细胞中靶向调控 RAP1B
为探究 RAP1B 发挥作用的下游信号通路，我们通过 LinkedOmics 数据库预测了 RAP1B 的相关基因（图 4l），京都基因与基因组百科全书富集分析显示，这些基因富集于多条信号通路（图4m）。其中，PI3K/AKT 信号通路的激活是前列腺癌中最常见的分子事件，该通路可促进前列腺癌细胞的生长、侵袭和转移，在肿瘤发生、进展及治疗抵抗中发挥关键作用。因此，我们检测了 RAP1B 对 PI3K/AKT 信号通路的调控作用，蛋白质免疫印迹实验结果显示，过表达 RAP1B 可显著上调 PI3K 和 AKT 的磷酸化水平，而对二者的总蛋白表达无显著影响（图 4n）。以上结果提示，RAP1B 可能通过激活 PI3K/AKT 信号通路在前列腺癌中发挥癌基因作用。
6、RAP1B可逆转miR-149对前列腺癌细胞生物学功能的抑制作用
为验证 miR-149 是否通过靶向调控 RAP1B 发挥生物学功能，我们开展了挽救实验。转染 RAP1B 过表达载体后，细胞中 RAP1B 的表达显著上调，证实了转染效率。功能实验结果显示，过表达 RAP1B 可逆转过表达 miR-149 对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用；同时，过表达 miR-149 介导的 E - 钙粘蛋白上调和 N - 钙粘蛋白下调效应，也可被过表达 RAP1B 部分逆转。此外，过表达 RAP1B 还可逆转过表达 miR-149 导致的细胞外酸化率降低和耗氧率升高。相关性分析显示，22Rv1 和VCaP 细胞中 miR-149 与 RAP1B 的表达呈显著负相关。以上结果表明，miR-149 通过直接靶向 RAP1B，抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮 - 间质转化及糖酵解过程。
7、敲低RAP1B抑制前列腺癌细胞的恶性生物学功能
为单独探究 RAP1B 在前列腺癌中的生物学功能，我们在 22Rv1 和 VCaP 细胞中敲低 RAP1B，荧光定量 PCR 结果显示，sh-RAP1B 可显著下调 RAP1B 的表达，证实了转染效率。功能实验结果显示，敲低 RAP1B 可显著抑制前列腺癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力；蛋白质免疫印迹实验结果显示，敲低 RAP1B 可上调 E - 钙粘蛋白的表达，下调 N -钙粘蛋白的表达；细胞能量代谢检测实验显示，敲低 RAP1B 可降低细胞的细胞外酸化率、提高耗氧率。以上结果表明，RAP1B 作为癌基因，可促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮 - 间质转化及糖酵解过程。
8、ESRP1促进circPHGDH的生物合成
鉴于剪接因子可调控环状RNA 的环化过程，我们通过功能筛选探究调控 circPHGDH 生物合成的剪接因子。结果显示，敲低剪接因子 ESRP1 可特异性降低 circPHGDH 的表达，而敲低其他剪接因子对其表达无显著影响（图 5a），因此我们选择 ESRP1开展后续研究。
临床样本相关性分析显示，前列腺癌组织中 ESRP1 的表达与 circPHGDH 的表达呈显著正相关（r=0.670，P<0.001；图 5b）。RNA 免疫沉淀实验和体外 RNA 下拉实验证实，ESRP1 蛋白可与 circPHGDH 直接相互作用（图 5c、d）。生物信息学分析在 circPHGDH 编码外显子两侧的内含子中预测到多个 ESRP1 潜在结合基序（图 5e），RNA 免疫沉淀实验进一步证实，ESRP1 可与 PHGDH 前体信使 RNA 的 A、B、C、E 区域结合（图 5f）。
定点突变实验验证了这些结合基序的功能重要性，结果显示，敲低 ESRP1 可显著降低野生型迷你基因载体介导的 circPHGDH 表达，而当 A/B/C/E、A/B 或 C/E 基序发生突变后，该下调效应被逆转（图 5g）。此外，敲低 ESRP1 可显著上调线性 PHGDH 的表达（图 5h）。以上结果表明，ESRP1 通过结合circPHGDH 编码外显子两侧内含子中的 A、B、C、E 基序，促进 circPHGDH 的生物合成。
图 5 ESRP1促进circPHGDH的生物合成
9、敲低circPHGDH抑制前列腺癌细胞中ESRP1在K43位点的乳酸化修饰
肿瘤糖酵解产生的乳酸是蛋白质乳酸化修饰的底物，可促进肿瘤的恶性进展。本研究中，我们重点探究了剪接因子 ESRP1 的乳酸化修饰。实验结果显示，乳酸处理可同时上调 ESRP1 的蛋白表达水平和乳酸化修饰水平（图 6a）。如前所述，敲低circPHGDH 可抑制前列腺癌细胞的糖酵解，因此我们检测了 circPHGDH 对 ESRP1 乳酸化修饰的调控作用。结果显示，与 sh-NC 组相比，敲低 circPHGDH 可显著降低 ESRP1 的蛋白表达水平和乳酸化修饰水平（图 6a）。
随后，我们检测了 ESRP1的蛋白稳定性，cycloheximide追踪实验结果显示，乳酸处理可延长 ESRP1 的蛋白半衰期，而敲低 circPHGDH 则可缩短其半衰期（图 6b、c）。通过定点突变实验预测并验证 ESRP1 的乳酸化修饰位点，结果显示，乳酸处理可上调野生型 ESRP1 的乳酸化修饰水平和蛋白表达水平，而当 K43 位点发生突变（K43R）后，该上调效应被完全逆转；K252R、K507R 或 K511R 突变则对乳酸介导的 ESRP1 乳酸化修饰和蛋白表达无显著影响（图 6d）。以上结果表明，敲低 circPHGDH 通过抑制糖酵解，减少乳酸生成，进而抑制 ESRP1 在 K43 位点的乳酸化修饰，降低其蛋白稳定性；而乳酸处理则可产生相反的效应。
图 6 敲低circPHGDH抑制前列腺癌细胞中ESRP1在K43位点的乳酸化修饰
10、ESRP1通过上调circPHGDH的表达促进前列腺癌细胞的恶性生物学行为
为探究ESRP1是否通过调控 circPHGDH 发挥生物学功能，我们开展了联合实验。结果显示，过表达 ESRP1 可促进前列腺癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力，而同时敲低circPHGDH 则可逆转该促进作用（图7a-d）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，过表达 ESRP1 可下调 E - 钙粘蛋白、上调 N - 钙粘蛋白的表达，而敲低 circPHGDH 可逆转该表达趋势（图 7e）。细胞能量代谢检测实验显示，过表达 ESRP1 可提高细胞的细胞外酸化率、降低耗氧率，而敲低 circPHGDH 可逆转该代谢表型（图 7f、g）。以上结果表明，ESRP1 作为肿瘤促进因子，通过上调circPHGDH 的表达推动前列腺癌的恶性进展。
图 7 ESRP1 通过上调 circPHGDH 的表达促进前列腺癌细胞的恶性生物学行为
11、敲低circPHGDH通过调控miR-149/RAP1B轴在体内抑制肿瘤生长和转移
为验证circPHGDH/miR-149/RAP1B 轴在体内的功能，我们构建了前列腺癌裸鼠异种移植瘤模型。荧光定量 PCR 结果显示，22Rv1 细胞中稳定转染 lv-sh-circPHGDH 可显著下调 circPHGDH 的表达，稳定转染 lv-RAP1B 可显著上调 RAP1B 的表达（图 8a、b）。将上述稳转细胞皮下接种至裸鼠体内，待肿瘤形成后，向瘤内多点注射 antago-miR-149 或 antago-nc。
活体荧光成像结果显示，敲低circPHGDH 可显著降低肿瘤的平均荧光强度，提示肿瘤转移受到抑制；而抑制 miR-149 或过表达 RAP1B 则可逆转敲低 circPHGDH 对肿瘤转移的抑制作用（图 8c、d）。此外，敲低 circPHGDH 可显著减小肿瘤的体积、降低肿瘤重量，而抑制 miR-149 或过表达 RAP1B 可逆转该效应（图 8e-g）。免疫组化实验结果显示，敲低 circPHGDH 可显著下调肿瘤组织中 Ki67 的表达，而抑制 miR-149 或过表达 RAP1B 可逆转该下调效应（图 8h）。组织病理学染色结果显示，敲低 circPHGDH 可减轻肿瘤组织的恶性病理特征，而抑制 miR-149 或过表达 RAP1B 可逆转该效应（图 8h）。以上体内实验结果表明，circPHGDH 通过调控 miR-149/RAP1B 轴，促进前列腺癌的体内生长和转移。
图 8 敲低circPHGDH通过调控miR-149/RAP1B轴在体内抑制肿瘤生长和转移
12、过表达circPHGDH在体内促进肿瘤转移和生长
我们还探究了过表达circPHGDH 在体内的生物学功能。结果显示，22Rv1 细胞中稳定转染lv-circPHGDH 可显著上调circPHGDH 的表达。将稳转细胞皮下接种至裸鼠体内，活体荧光成像结果显示，lv-circPHGDH 组肿瘤的平均荧光强度显著高于 lv-nc 组，提示过表达 circPHGDH 可促进肿瘤转移。此外，过表达 circPHGDH 可显著增大肿瘤体积、增加肿瘤重量。免疫组化实验结果显示，过表达 circPHGDH 可显著上调肿瘤组织中 Ki67 的表达；组织病理学染色结果显示，过表达 circPHGDH 可加重肿瘤组织的恶性病理特征。以上结果进一步证实，circPHGDH 在体内可促进前列腺癌的生长和转移。
结论
总之，本研究揭示，剪接因子ESRP1可促进circPHGDH的生物合成。这种致癌性环状RNA进而通过调控miR-149/RAP1B轴促进前列腺癌细胞的糖酵解，由此产生的乳酸通过乳酸化稳定ESRP1。这一新型正反馈环路会增强前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化，从而加速前列腺癌的进展。本研究为前列腺癌的发病机制提供了新见解，并表明靶向这一调控轴可能是一种有前景的治疗策略。
参考文献
Wang X, Yu L, Qian X, Yu Z. A ESRP1/circPHGDH/miR-149/RAP1B positive feedback loop promotes the malignant behaviors and glycolysis of prostate cancer cell. Exp Mol Med. 2026 Feb 27. doi: 10.1038/s12276-026-01646-x. Epub ahead of print. PMID: 41760734.