METTL3在急性肺损伤过程中通过SYK-ERK-MEK信号通路促进中性粒细胞胞外诱捕网的形成

   急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的疾病，其特征是压倒性的肺部炎症和中性粒细胞浸润。中性粒细胞通过释放蛋白水解酶、活性氧和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在ALI发病机制中发挥核心作用。尽管NET有助于病原体清除，但过度的NET形成加剧了组织损伤并放大了炎症。m6A是真核RNA中最丰富的内部修饰物，通过调节RNA的稳定性和翻译在免疫细胞调控中起关键作用。然而，在ALI期间m6A修饰如何控制NETosis仍不完全清楚。髓系或中性粒细胞谱系中METTL3的条件缺失显著降低了脂多糖（LPS）诱导的ALI后肺MPO活性、瓜氨酸组蛋白H3水平和细胞外DNA沉积。METTL3缺乏可减轻肺部炎症并减少中性粒细胞浸润。在体外，METTL3缺陷的中性粒细胞在PMA刺激下表现出NET形成减少，SYK磷酸化和下游ERK /MEK激活减少。从机制上讲，METTL3促进SYK mRNA的m6A甲基化，增强其稳定性和转录。药理抑制METTL3或SYK重现保护性表型，抑制NETosis和体内肺损伤。总的来说，我们的研究结果揭示了一种新的METTL3-SYK表转录组轴，该轴在内毒素诱导的肺损伤期间控制中性粒细胞效应反应。这些结果强调了m6A依赖性转录后调控作为ALI和败血症相关炎症的潜在治疗靶点。本文于2026年1月发表于Journal of Advanced Research（IF=13.0）上。

技术路线：

结果：

1）METTL3缺乏可减轻ALI患者的中性粒细胞募集和肺损伤

   为了探索急性肺损伤（ALI）期间METTL3在中性粒细胞中的作用，我们产生了中性粒细胞特异性METTL3敲除小鼠。这些小鼠及其同窝对照小鼠接受气管内脂多糖（LPS）刺激以诱导ALI（图1A）。LPS给药后6小时，取中性粒细胞浸润、肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）峰值对应的时间点进行流式细胞术分析。我们观察到，与野生型（WT）幼崽相比，METTL3 cKO小鼠肺组织和BALF中CD45+CD11b+Ly6G+中性粒细胞的数量显著减少（图1B-D)。组织学检查进一步证实METTL3 cKO小鼠肺部炎症减轻。H&E染色显示，与WT对照组相比，METTL3 cKO肺的肺泡壁增厚减少，白细胞浸润最小，肺泡结构保存更好，肺泡塌陷广泛存在，细胞浸润，肺结构破坏（图1F-G）。重要的是，在LPS刺激后，METTL3 cKO小鼠肺实质中埃文斯蓝的积累显著降低，表明METTL3驱动的NET形成有助于ALI的内皮渗漏（图1E)。为了阐明METTL3在ALI期间中性粒细胞NET形成中的作用，我们进一步分析了与NET相关的标志物。MPO活性在METTL3 cKO小鼠的全肺裂解物和支气管肺泡细胞中显著降低（图1H-I）。Western blot显示，H3Cit在METTL3缺陷小鼠的肺组织中也减少（图1J）。这些研究结果表明，在LPS诱导的ALI过程中，METTL3是有效的中性粒细胞募集和激活所必需的，缺乏METTL3对肺部炎症和损伤具有重要的保护作用。

2）中性粒细胞METTL3促进体外NET的形成

   为了确定METTL3是否调控NET的形成，我们通过中性粒细胞染色体外观察NETs。ALI小鼠的中性粒细胞表现出强大的NET形成（图2A-B）。有趣的是，在ALI小鼠的血液中性粒细胞和肺组织以及经PMA处理的骨髓源性中性粒细胞（BMNeu）中m6A RNA修饰水平升高（图2C）。我们检查了m6A的主要调节因子，发现PMA处理后METTL3显著增加（图2-D-E）。为了直接评估METTL3在NET形成中的功能，我们用METTL3抑制剂STM2457处理dHL60细胞。METTL3的抑制减少了NET的形成（图2F-G）。经PMA处理的WT BMNeu显示出强大的NET形成（图2H）。相比之下，来自METTL3 cKO小鼠的中性粒细胞显示出明显较少的细胞外DNA结构（图2H)。与WT中性粒细胞相比，这些细胞的NET形成减少了67%（图2I）。METTL3缺乏还导致MPO活性（图2J）、ROS产生（图2K）和组蛋白H3瓜氨酸化（图2L-M）降低。综上所述，这些数据表明METTL3促进了NET的形成并触发了下游效应功能。

3）METTL3通过SYK/ERK/MEK信号轴促进NETosis

   Dot blot分析证实，METTL3缺失导致中性粒细胞中m6A修饰减少（图3A）。为了描述METTL3如何调节NETosis，我们进行了MeRIP-seq。m6A峰富集的差异突出了ERK/MAPK通路和ROS产生的显著变化（图3B）。接下来，我们进行了基于维恩图的富集分析，以确定潜在的靶基因，发现了三个候选基因：SYK、TLR4和Ptk2b（图3C）。qPCR证实，只有SYK在METTL3缺陷（M3cKO）中性粒细胞中显著下调（图3D）。在基线和PMA治疗后，METTL3 cKO BMNeu和METTL3 KD dHL60中SYK mRNA和蛋白的表达显著降低（图3E-G）。与NETosis期间的对照组相比，METTL3缺陷（M3cKO）中性粒细胞和METTL3 KD dHL60中的ERK/MEK激活被证实大幅降低（图3F）。METTL3敲低的dHL60细胞中SYK的过表达增加了PMA诱导的SYK磷酸化水平（图3H），并恢复了PMA刺激后的NET形成（图3I-J）。这些数据证实SYK是METTL3的直接m6A靶点，并通过SYK/ERK/MEK信号轴调控NETosis。

4）METTL3依赖的SYK表达促进败血症诱导的肺损伤

   接下来，我们探讨了ALI中的METTL3-SYK轴的体内相关性。流式细胞分析显示，与METTL3 cKO小鼠相比，LPS刺激后WT小鼠肺浸润中性粒细胞中SYK的表达更高（图4A-B）。接下来，我们通过慢病毒注射在METTL3 cKO小鼠中过表达SYK。通过流式细胞术染色和Western Blot分析证实了SYK在肺组织和中性粒细胞中的成功过表达（图4C-D）。SYK过表达消除了METTL3 cKO ALI中的有益作用（图4E-F）。重要的是，SYK过表达恢复了肺组织中的H3Cit水平，这表明METTL3驱动的SYK表达主要通过NET形成促进肺损伤进展（图4G）。为了评估SYK在脓毒症诱导的肺损伤中的作用，小鼠在ALI诱导前两天腹腔注射SYK磷酸化抑制剂R406。组织病理学和Evans蓝染色显示，R406治疗减轻了肺损伤，并降低了肺中的MPO活性和H3Cit（图4H-K）。我们还注意到ALI肺中METTL3缺陷中性粒细胞的膜结合TLR2表达减少（图4L-M）。在机制上，SYK调节TLR2的表达。急性肺损伤时，腹腔注射R406可有效降低中性粒细胞中TLR2的表达（图4N-O），而SYK过表达可恢复METTL3缺陷细胞中TLR2的表达（图4P）。这些发现表明SYK在脓毒症诱导的ALI中是METTL3的关键下游效应因子，在NETosis的调节中是METTL3的直接下游效应因子。

5）METTL3通过m6A修饰稳定SYK mRNA

   为了进一步研究METTL3控制SYK表达的机制，我们使用MeRIP-seq分析了SYK转录本上m6A的修饰。我们在WT中性粒细胞中SYK mRNA的3'UTR中发现了强烈的m6A峰，而在METTL3缺失的细胞中，m6A峰明显减少（图5A）。MeRIP-qPCR证实，SYK转录本在WT细胞中优先甲基化（图5B)。定量PCR显示，在PMA刺激下，METTL3缺陷中性粒细胞中SYK mRNA水平降低（图5C）。为了区分转录调控和转录后调控，我们进行了Actinomycin D追逐实验。SYK mRNA在METTL3缺失的细胞中降解更快，表明METTL3延长了SYK转录物的稳定性（图5D-E）。相比之下，新生RNA标记仅显示SYK转录的适度减少（图5F）。使用WT或突变SYK 3 ' UTRs构建的荧光素酶报告基因试验表明，m6A位点的缺失显著降低了报告基因活性（图5G）。这些数据共同表明，METTL3介导的m6A修饰稳定了SYK mRNA，支持持续的蛋白表达和NET形成所必需的下游信号。

6）药理抑制METTL3可抑制NETosis并改善肺预后

   为了评估靶向METTL3的治疗潜力，我们用METTL3抑制剂STM2457处理WT小鼠。STM2457治疗显著降低肺组织和分选的血液中性粒细胞中m6A水平（图6A）。重要的是，通过流式细胞术测量，STM2457处理小鼠肺组织中的中性粒细胞积累显著减少（图6B-C）。组织学分析显示，经STM2457处理的小鼠肺形态得到改善，肺泡塌陷和炎症浸润减少（图6D-E）。肺血管渗漏也明显减少（图6F）。流式细胞术显示，STM2457降低了肺组织中SYK的表达水平和SYK阳性中性粒细胞的百分比（图6G-I)。生化分析证实，治疗后肺组织的MPO活性和H3Cit表达降低（图6J-K)。这些发现表明，药物抑制METTL3可以减轻NET的形成、中性粒细胞活化和肺损伤，这可能是治疗ALI和脓毒症的一种有希望的策略。

结论：

   我们的研究揭示了METTL3通过SYK/ERK/MEK轴调控中性粒细胞活化和NETosis的表转录组学机制。这些发现表明m6A依赖性RNA调控是免疫控制的关键层，为ALI和其他中性粒细胞驱动疾病的治疗提供了新的治疗途径。

参考文献：

Luo S, Zhang Q, Zhou W, Zhang L, Liao C, Zeng D, Zhang L, Xiang FL, Xu J, Tang J. METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury. J Adv Res. 2026 Jan 22:S2090-1232(26)00069-X.