TRIM3/TLR3轴克服IFN-β的反馈抑制作用，从而抑制非小细胞肺癌的进展

   干扰素-β（IFN-β）具有强大的抗肿瘤活性，但其临床治疗潜力受到抑制IFN-β产生的内在负反馈环路的影响。然而，调控非小细胞肺癌（NSCLC）中IFN-β稳态的反馈机制仍不明确。本研究发现，三重基序蛋白3（TRIM3）可促进IFNB1的转录及mRNA表达。相反，过量的IFN-β会抑制TRIM3的表达，形成二者的相互反馈环路。质谱分析显示，触发IFN-β产生的关键传感器——Toll样受体3（TLR3）是TRIM3的相互作用伙伴。在阐明TRIM3与TLR3的相互作用模式后，作者发现激活TRIM3/TLR3轴可诱导IFN-β分泌，并突破该反馈抑制。持续的IFN-β分泌随后通过提高CD4+T细胞、M1型巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞的浸润水平，抑制NSCLC细胞增殖并重塑肿瘤微环境。本研究结果揭示了IFN-β信号调控中的相互负反馈环路，强调了TRIM3/TLR3轴在抑制NSCLC进展中的作用，并为抑制肿瘤生长和提高NSCLC免疫治疗效果提供了一种有前景的策略。这篇文章于2026年1月发表于《Cell Death & Disease》期刊上，IF:9.6。

研究技术路线：

主要实验结果：

1、鉴定TRIM3是非小细胞肺癌中干扰素刺激反应的靶标

   为鉴定与干扰素分泌相关的潜在泛素修饰酶，作者对GEO数据库中干扰素刺激的肺癌细胞RNA测序数据集进行了筛选。GSE226667数据集揭示了经复合干扰素处理的A549肺癌细胞全基因组表达谱。作者选取排名前500的差异表达基因（DEGs），并与655个已知的泛素-蛋白酶体系统相关基因进行交集分析，得到7个干扰素应答候选基因（图1A、B）。在这些基因中，由于TRIM3在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达差异最为显著，因此被选为进一步研究的对象。TRIM3 mRNA的表达在包括肺腺癌（LUAD）和鳞状细胞癌（LUSC）在内的大多数癌症类型中也显著下调（图1C）。在多种肿瘤的皮下肿瘤模型中，与程序性死亡受体1（PD-1）、程序性死亡配体1（PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）抑制剂或其他细胞因子的应答不同，在路易斯肺癌（LLC）模型中，TRIM3 mRNA表达仅在干扰素-β（IFN-β）刺激后降低（图1D、E）。这些发现表明，TRIM3在NSCLC中对IFN-β刺激表现出独特的应答。

Fig. 1 鉴定TRIM3是非小细胞肺癌中干扰素刺激反应的靶标

2、TRIM3与IFN-β的相互作用在NSCLC中形成相互反馈环路

   基于LLC小鼠模型中TRIM3 mRNA表达在IFN-β刺激后下调这一发现，作者接下来进行了体外实验，以验证IFN-β对TRIM3表达的影响。IFN-β刺激后，H1299、PC-9和A549细胞中TRIM3 mRNA表达下调（图2A）。使用酪氨酸激酶2（TYK2）抑制剂BMS-986165抑制I型IFN通路，以及通过基因敲除干扰素α和β受体亚基1（IFNAR1）和IFNAR2，均逆转了这种抑制作用，恢复了A549、H1299和PC-9细胞中TRIM3蛋白和mRNA的水平（图2B-D和S2A-C）。基于已有研究报道的I型IFN与泛素修饰酶之间的负反馈作用，作者推测TRIM3可能反过来调控IFN-β的产生。慢病毒介导的TRIM3敲除或过表达实验表明，TRIM3表达增加会提高IFNB1 mRNA水平，而其缺失则会降低A549、H1299和PC-9细胞中的IFNB1水平（图2E-H）。荧光素酶报告基因实验进一步证实了TRIM3依赖的IFNB1启动子转录激活（图2I-L）。这些发现表明，尽管TRIM3在NSCLC中增强IFNB1的转录，但过量的IFN-β会通过反馈抑制来抑制TRIM3的表达。

Fig. 2 TRIM3与IFN-β的相互作用在非小细胞肺癌中形成相互反馈环路

3、NSCLC细胞中TRIM3表达低于正常细胞

   为研究TRIM3在NSCLC进展中的作用，作者首先分析了其在不同肿瘤分期和淋巴结转移状态（N分期）的肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）患者中的mRNA水平。在LUAD和LUSC中，随着肿瘤分期和N分期的增加，TRIM3 mRNA表达逐渐降低（图3A-F）。蛋白质印迹法（WB）和实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析证实，肺癌细胞中的TRIM3表达低于正常的BEAS-2B支气管上皮细胞（图3G、H）。与这些发现一致，人NSCLC组织的免疫组织化学结果显示，肿瘤组织中的TRIM3蛋白水平低于邻近的正常组织（图3I）。值得注意的是，TRIM3表达降低与NSCLC患者的不良临床结局呈正相关（图3J）。此外，在LUAD和LUSC中，TRIM3表达与肿瘤浸润性CD4+T细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞的数量呈正相关，这表明TRIM3在促进免疫细胞向肿瘤微环境募集方面发挥作用（图3K-P和S3）。综上所述，这些数据表明TRIM3在NSCLC进展中具有抑癌作用。然而，细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和集落形成实验结果显示，TRIM3的过表达或敲除均不影响H1299和A549细胞的增殖能力。综上，上述发现表明，如前所述，IFN-β对TRIM3的反馈抑制可能会抑制TRIM3对NSCLC进展的抑制作用。

Fig. 3 非小细胞肺癌细胞中TRIM3表达低于正常细胞

4、TRIM3泛素化TLR3以诱导IFN-β分泌

   为研究调控IFN-β分泌和打破反馈抑制的机制，作者在H1299细胞中过表达TRIM3后，进行了免疫共沉淀（Co-IP）实验结合质谱分析，从而系统地绘制TRIM3相互作用组。根据独特肽段计数对免疫沉淀中富集的蛋白质进行排序，并将排名前100的候选蛋白与通过GeneCards鉴定的排名前100的IFNB1相关蛋白进行交叉比对（图4A）。Toll样受体3（TLR3）是触发IFN-β产生的关键双链RNA（dsRNA）传感器，且已知其受到泛素依赖性调控，最终成为仅有的重叠基因。TLR3可被合成dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞苷酸（poly(I:C)）激活。双向Co-IP实验验证了A549和H1299细胞中TRIM3与TLR3的体外物理相互作用（图4B-E和S5）。邻近连接测定（PLA）信号（红色）证实了A549和H1299细胞中TRIM3与TLR3的相互作用（图4F）。与其他TRIM家族泛素连接酶一样，TRIM3包含保守的环指结构域（RING）、B盒结构域（B-box）和卷曲螺旋结构域（coiled-coil），以及一个可变的C端区域。Co-IP实验表明，RING结构域对于TRIM3-TLR3相互作用至关重要（图4G）。关键的是，与野生型（WT）TRIM3相比，RING结构域缺失的TRIM3突变体和催化失活突变体（C22/25S）均未表现出TLR3泛素化活性（图4H）。鉴于TLR3驱动的IFN-β产生需要TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3）的磷酸化，作者还观察到在WT TRIM3组（而非C22/25S突变体组）中，磷酸化TBK1和IRF3伴随上调（图4I）。在A549和H1299细胞中进行的补充qPCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析证实，在poly(I:C)刺激下，TRIM3上调IFNB1转录并增强IFN-β分泌。值得注意的是，TLR3调控逆转了这些效应，恢复了基础IFNB1 mRNA和IFN-β水平（图4J和S6）。对NSCLC队列中TLR3表达的生物信息学分析显示，随着肿瘤分期和N分期的进展，TLR3表达逐渐下调。TLR3表达降低与NSCLC患者的不良预后呈正相关。这些结果表明，TRIM3通过其RING结构域促进TLR3泛素化，从而在NSCLC中诱导IFN-β分泌。

Fig. 4 TRIM3泛素化TLR3以诱导IFN-β分泌

5、TRIM3在赖氨酸808位点催化TLR3的K63连接泛素化

   为阐明泛素化机制，作者进行了泛素化特异性Co-IP实验。与连接特异性泛素构建体共转染表明，TRIM3选择性地催化TLR3的K63连接泛素化（图5A）。在后续实验中，作者证明TRIM3以剂量依赖方式通过K63连接（而非K63R突变体）泛素化促进TLR3泛素化（图5B、C）。TLR3/TBK1/IRF3信号轴的激活导致IFN-β分泌，这严格要求TLR3的切割。作者的结果还表明，poly(I:C)刺激增强了TLR3泛素化和切割型TLR3的积累，且这些效应通过TRIM3过表达得到放大（图5D）。结构域定位显示，TLR3中633-904位残基对于TRIM3结合至关重要（图5E）。使用GPS-Uber平台，作者预测了该区域内的四个候选赖氨酸泛素化位点。TLR3 K808残基的突变消除了TRIM3介导的TLR3泛素化（图5F）。WT TLR3显著增加了IFNB1 mRNA表达和IFN-β分泌，而K808R突变体则没有这些效应（图5G）。综上所述，这些发现表明，TRIM3在K808位点催化TLR3的K63连接泛素化，从而激活NSCLC中IFN-β的分泌。

Fig. 5 TRIM3在赖氨酸808位点催化TLR3的K63连接泛素化

6、TRIM3/TLR3轴抑制NSCLC进展

   为研究TRIM3/TLR3轴在NSCLC进展中的功能作用，作者进行了体外和体内实验。在poly(I:C)刺激下激活TLR3信号，进行增殖实验（CCK-8和集落形成）。TRIM3过表达抑制了A549细胞增殖，而TLR3敲除则逆转了这种效应（图6A、B）。此外，TRIM3敲除增强了H1299增殖，而TLR3过表达则逆转了这种效应（图6C、D）。在LLC细胞中也观察到了一致的结果（图6E、F和S8）。在作者的同基因小鼠模型中，每3天腹腔注射一次poly(I:C)。15天后，切除肿瘤、称重并拍照（图6G）。作者发现TRIM3过表达显著抑制了肿瘤生长，但TLR3敲除逆转了这种效应（图6H-J）。肿瘤组织的免疫组织化学结果显示，TRIM3过表达增加了IFN-β水平，并提高了CD4⁺T细胞、CD49b⁺NK细胞和CD86⁺M1巨噬细胞的浸润水平，但CD163⁺M2巨噬细胞的浸润水平降低（图6K），这与先前的免疫浸润分析结果一致（图3K-P）。生物信息学分析还证实了TLR3表达与LUAD和LUSC中CD4⁺T细胞、巨噬细胞、NK细胞（图7A-H）、CD8⁺T细胞和树突状细胞浸润的相关性。临床上，TRIM3和TLR3的下调与NSCLC患者的不良预后呈正相关（图7I）。总体而言，TRIM3/TLR3轴通过直接抑制肿瘤细胞增殖并通过IFN-β分泌调节免疫细胞的浸润水平，从而抑制NSCLC进展（图7J）。

Fig. 6 TRIM3/TLR3轴抑制非小细胞肺癌进展

Fig. 7 TLR3与免疫浸润的关联及TRIM3/TLR3联合表达在非小细胞肺癌中的预后价值

结论

   总而言之，本研究揭示了NSCLC中调控IFN-β分泌的相互反馈环路。TRIM3可促进IFNB1的表达，而过量的IFN-β则通过反馈抑制诱导TRIM3下调。值得注意的是，TLR3轴通过TRIM3介导的、K808位点发生的TLR3 K63连接泛素化，突破了这种反馈抑制，进而抑制NSCLC细胞增殖并阻碍肿瘤生长。这些发现深化了对IFN-β信号动态调控的机制理解，并证实TRIM3/TLR3轴是NSCLC中一个具有潜力的治疗靶点。

参考文献

Xu J, Hu Q, Zhu Y, Liu Q, Wang F, Yu Y, Wang W, Ding X. The TRIM3/TLR3 axis overrides IFN-β feedback inhibition to suppress NSCLC progression. Cell Death Dis. 2026 Jan 16;17(1):44. doi: 10.1038/s41419-025-08265-w. PMID: 41545343; PMCID: PMC12811290.