AARS1介导的H3K18与STAT1乳酸化修饰促进糖尿病肾病中铁死亡的发生

   糖尿病肾病（DN）是全球范围内导致终末期肾病的主要原因。近期研究揭示，乳酸介导的组蛋白乳酸化作为一种新型表观遗传修饰，参与了糖尿病相关并发症的发生与发展。然而，乳酸转移酶在DN中的作用尚不明确。丙氨酰-tRNA合成酶1（AARS1）被鉴定为一种新型乳酸转移酶，可调控组蛋白H3第18位赖氨酸的乳酸化修饰（H3K18la）。本研究旨在探究AARS1介导的H3K18la是否参与DN的发病机制，并进一步阐明其潜在的作用机理。本研究采用野生型与丙氨酰-tRNA合成酶1（AARS1）杂合子（AARS1+/–）小鼠构建的DN模型。通过转录组学与脂质组学分析，并结合多种分子生物学方法，系统阐明了AARS1调控DN中铁死亡过程的潜在机制。研究结果表明，在DN模型中，AARS1与H3K18la的表达升高通过调控铁死亡参与肾功能障碍和肾细胞死亡进程。此外，AARS1通过增加脂肪酸延长酶-5（ELOVL5）的转录诱导脂质过氧化，最终导致铁死亡的发生。进一步研究发现，AARS1与信号转导和转录激活因子1（STAT1）相互作用，共同调控ELOVL5的转录；而使用STAT1特异性抑制剂氟达拉滨可延缓DN进展。同时，研究观察到AARS1通过调控STAT1和H3K18的乳酸化修饰来调节ELOVL5转录，从而触发铁死亡。通过β-丙氨酸抑制AARS1诱导的乳酸化可减轻DN模型小鼠和高糖状态细胞的铁死亡程度。本研究证实，在糖尿病肾病模型中，AARS1通过诱导H3K18和STAT1的乳酸化修饰调控ELOVL5转录，进而触发铁死亡过程。该研究于2025年10月发表在《Cell Death & Differentiation》，IF：15.4。

技术路线：

主要研究结果：

1.AARS1与H3K18la在糖尿病肾病（DN）患者及模型中的表达上调

   本研究纳入的DN患者临床特征见补充表1。根据估算肾小球滤过率（eGFR），DN患者被分为2期、3期或4期。图1A展示了DN患者肾脏样本的苏木精-伊红（HE）染色结果。Masson三色染色显示，随着DN分期的进展，胶原沉积与间质纤维化程度显著加重（图1A）。与此一致的是，TUNEL检测结果表明，随着DN分期进展，患者肾脏中的细胞死亡数量也相应增加（图1A）。此外，细胞死亡现象在肾小管和肾小球中均被观察到（图1A）。既往研究[21-23]提示H3K18la可能参与糖尿病相关并发症的发生与发展。同时，已有研究证实AARS1是调控H3K18la的新型乳酸转移酶[24,25]。因此，我们对DN患者肾脏组织中AARS1、乳酸化修饰及H3K18la的水平进行了检测。数据显示，随着DN分期的进展，患者肾脏中AARS1、乳酸化修饰及H3K18la的水平均显著升高（图1A）。本研究中小鼠的血清生化指标见补充表2。苏木精-伊红（HE）和Masson三色染色显示，DN小鼠肾脏发生显著病理改变（图1B）。TUNEL染色结果表明，DN小鼠肾脏的细胞死亡数量有所增加（图1B）。此外，DN小鼠肾脏中AARS1蛋白、乳酸化修饰及H3K18la的水平均出现升高（图1B、C）。与此一致的是，AARS1的mRNA水平在DN小鼠肾脏中也呈现上调趋势（图1D）。

   此外，高糖处理可使人肾小球内皮细胞（HGECs）和人肾小管上皮细胞（HK-2）中AARS1、乳酸化修饰及H3K18la的水平增加（补充图1A、B）。同时，高糖状态下的细胞死亡程度也显著增强（补充图1C）。值得注意的是，作为渗透压对照的甘露醇处理，对高糖细胞中的AARS1、乳酸化修饰、H3K18la水平以及细胞死亡均未产生影响（补充图1A–C）。以上数据共同表明，AARS1、乳酸化修饰及H3K18la在DN患者和疾病模型中均呈现表达上调。

图1. AARS1与H3K18la在糖尿病肾病（DN）患者及模型中的表达上调

2.AARS1表达上调参与糖尿病肾病（DN）的疾病进程

   为深入探究AARS1在DN中的作用，我们利用AARS1杂合子（AARS1+/–）小鼠构建了DN模型（AARS1+/– DN小鼠），相关实验设计见图2A–C。与DN小鼠相比，AARS1+/– DN小鼠表现出以下特征：肾脏组织结构损伤减轻、纤维化程度缓解、肾细胞死亡减少、AARS1蛋白水平及其介导的乳酸化修饰与H3K18la水平降低（图2A–C），同时肾功能指标得到改善（补充表2）。

   与此相一致的是，在高糖细胞中沉默AARS1可降低AARS1及H3K18la的表达水平（图2D、E）。此外，沉默AARS1能够逆转高糖诱导的人肾小球内皮细胞（HGECs）和人肾小管上皮细胞（HK-2）的死亡（图2F）。进一步研究发现，AARS1抑制剂Gln-AMS能以浓度和时间依赖性的方式抑制AARS1及H3K18la的表达（补充图1D、E），并且该抑制剂处理也能减少高糖状态下的细胞死亡（补充图1F）。以上数据表明，AARS1诱导的H3K18la修饰参与了DN的疾病发展过程。

图2.AARS1表达上调参与糖尿病肾病（DN）的疾病进程

3.AARS1上调通过触发铁死亡参与糖尿病肾病（DN）的发病机制

   为深入探究AARS1诱导的H3K18la修饰参与DN发病的机制，我们对小鼠肾脏组织进行了RNA-seq分析。数据显示，在DN小鼠肾脏中，与不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸延长、脂肪酸代谢及代谢通路相关的KEGG通路显著富集（图3A，补充表3）。既往研究提示，多不饱和脂肪酸（PUFA）生物合成通路在铁死亡过程中起关键作用[15]。与此相一致的是，随着DN分期进展，患者肾脏组织中4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）、丙二醛（MDA）及长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）水平逐渐升高，而谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）水平逐渐降低（图3B），表明铁死亡参与了DN的发展过程。

   我们进一步通过铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）处理DN小鼠及高糖暴露细胞，验证铁死亡是否参与DN的进展。Fer-1处理可减轻肾脏组织损伤、抑制ACSL4表达并提高GPX4水平（补充图2A、B）。透射电子显微镜（TEM）观察显示，DN小鼠肾脏细胞呈现出线粒体结构致密、嵴显著减少、体积缩小等铁死亡特征性改变，而Fer-1处理能有效缓解这些超微结构异常（补充图2A）。此外，Fer-1还能降低DN小鼠肾脏MDA和脂质过氧化物（LPO）沉积、减少Fe²⁺含量并改善肾功能障碍（补充图2C–E；补充表2）。

   在高糖细胞中，Fer-1能以时间和浓度依赖性的方式减少细胞死亡（补充图3A），同时降低ACSL4表达并提升GPX4水平（补充图3B）。采用脂质过氧化探针C11-BODIPY 581/591进行荧光染色，结果显示Fer-1可抑制高糖介导的脂质过氧化反应（补充图3C）。通过线粒体膜电位（MMP）探针JC-1的荧光染色发现，Fer-1处理能改善高糖诱导的HGECs和HK-2细胞MMP破坏（补充图3D），并降低高糖引起的MDA水平升高（补充图3E）。特异性Fe²⁺探针FeRhoNox-1荧光染色表明，Fer-1处理可降低高糖细胞内的Fe²⁺含量（补充图3F）。线粒体特异性超氧化物指示剂MitoSOX Red荧光染色显示，Fer-1处理能减少线粒体超氧化物的积累（补充图3G）。我们检测了DN模型中的铁死亡相关指标，以进一步证实AARS1诱导的H3K18la调控DN中铁死亡的过程。数据显示，与DN小鼠相比，AARS1+/– DN小鼠的肾脏表现出以下变化：ACSL4表达降低、GPX4水平升高、透射电镜（TEM）图像显示铁死亡形态改善、MDA与LPO含量减少、Fe²⁺含量下降（图3C–G）。

   同样地，高糖处理的HGECs和HK-2细胞中铁死亡标志物水平升高，而这一现象可通过沉默AARS1得以逆转（补充图4）。与此一致的是，Gln-AMS处理能够抑制高糖细胞中的铁死亡过程（补充图5）。这些数据表明，AARS1诱导的H3K18la表达通过触发铁死亡参与DN的发病机制。

图3.AARS1上调通过触发铁死亡参与糖尿病肾病（DN）的发病机制

4.AARS1诱导的H3K18la通过调控ELOVL5转录参与糖尿病肾病（DN）模型中的铁死亡过程

   接下来，我们深入探究了AARS1诱导的H3K18la参与DN患者铁死亡的具体机制。RNA-seq分析显示，脂肪酸延长酶5（ELOVL5）、反式-2,3-烯酰辅酶A还原酶（TECR）和3-羟基脂酰辅酶A脱水酶1（HACD1） 共同参与了不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、脂肪酸延长及代谢通路（补充图6A，补充表3）。值得注意的是，在这三个基因中，仅ELOVL5 出现在H3K18la的ChIP-seq结果中（补充表4）。ChIP实验证实，AARS1与H3K18la仅通过引物3（P3）富集在ELOVL5启动子区域；Re-ChIP实验进一步表明，AARS1与H3K18la共同占据ELOVL5启动子的相同区域（补充图6B）。

   随着DN分期进展，患者肾脏中ELOVL5表达水平逐渐升高（补充图6C）。与之相一致的是，ELOVL5在DN模型小鼠（补充图6D–F）和高糖细胞（补充图6G、H）中均呈现上调表达。抑制ELOVL5表达可减轻高糖诱导的HGECs和HK-2细胞的铁死亡（补充图7）。对高糖处理的ELOVL5沉默细胞进行脂质代谢分析显示，包括花生四烯酸（AA）在内的多不饱和脂肪酸（PUFA）生成减少（补充图8A，补充表5）。免疫荧光数据显示，ELOVL5主要定位于内质网（补充图8B）。更重要的是，在ELOVL5沉默细胞中加入AA可逆转si-ELOVL5对高糖介导的铁死亡的保护作用（补充图8C–H）。此外，ELOVL5沉默也能减轻铁死亡诱导剂FINO2介导的铁死亡（补充图9）。这些数据表明，在DN患者中，ELOVL5通过调控内质网中的PUFA合成来触发铁死亡。

   随后，我们验证了AARS1是否通过调控ELOVL5转录来介导DN患者的铁死亡。数据显示，过表达AARS1可增加细胞内ELOVL5表达（图4A、B）并促进铁死亡（图4）。而沉默ELOVL5则能消除AARS1过表达对铁死亡的促进作用（图4）。此外，抑制AARS1表达可降低DN模型小鼠肾脏（补充图10A–C）及高糖细胞（补充图10D–G）中的ELOVL5水平。这些数据共同表明，AARS1在DN模型中通过增强ELOVL5转录来促进铁死亡。

图4.AARS1诱导的H3K18la通过调控ELOVL5转录参与糖尿病肾病（DN）模型中的铁死亡过程

5.AARS1在体内外与信号转导和转录激活因子1（STAT1）直接相互作用

   基因启动子区域的组蛋白修饰常与转录因子结合并存，共同调控下游基因的转录。为鉴定与AARS1相互作用的转录因子，本研究进行了质谱分析。数据显示，STAT1可能与AARS1存在相互作用（图5A，补充表6）。通过免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光（IF）实验，我们证实STAT1在HGECs和HK-2细胞中与AARS1结合（图5B、C），而GST pull-down实验进一步验证了AARS1与STAT1之间的直接结合（图5D）。

   此外，我们评估了STAT1在DN患者肾活检样本和DN模型中的表达情况。数据显示，STAT1水平随DN分期进展逐渐升高（图5E）。与此一致的是，STAT1在DN模型小鼠肾脏（图5F–H）及高糖细胞（图5I、J）中表达均呈现上调。

图5. AARS1在体内外与信号转导和转录激活因子1（STAT1）直接相互作用

6.STAT1通过调控ELOVL5转录参与糖尿病肾病（DN）模型中的铁死亡过程

   为探究STAT1对ELOVL5表达及铁死亡的影响，我们进行了功能缺失与功能获得实验。沉默STAT1可降低ELOVL5水平，并抑制高糖诱导的HGECs和HK-2细胞铁死亡（补充图11）。相反，过表达STAT1可上调ELOVL5表达并激活铁死亡，而这一效应可被沉默ELOVL5所消除（补充图12）。为验证STAT1是否直接调控ELOVL5转录，本研究进行了染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因实验。ChIP实验显示STAT1富集于ELOVL5启动子区域，Re-ChIP实验进一步证实STAT1与AARS1共同占据ELOVL5启动子的相同区域（补充图13A）。通过JASPAR数据库（https://jaspar.genereg.net/）预测STAT1在ELOVL5启动子区域的潜在结合位点（见补充表7），其基序标识和位置权重矩阵分别展示于上下两栏（补充图13B）。随后，我们构建了这两个结合位点突变的质粒，发现突变后ELOVL5转录活性显著受抑制（补充图13C）。因此，我们认为STAT1直接结合ELOVL5启动子区域并参与其转录调控。

   为探究STAT1是否可作为抑制DN铁死亡的潜在靶点，我们进行了以下研究：在细胞实验中，使用STAT1特异性抑制剂氟达拉滨（Flu）处理。结果显示，氟达拉滨能以浓度和时间依赖性方式抑制STAT1表达（补充图14A）。此外，Flu不仅能抑制STAT1表达，还可降低ELOVL5水平（补充图14B、C），进而抑制下游铁死亡过程（补充图14B–I）。与此一致的是，在DN模型小鼠腹腔注射氟达拉滨可有效下调STAT1和ELOVL5表达（图6A–C），抑制铁死亡（图6A–F），减轻肾组织损伤（图6A），并显著改善肾功能障碍（补充表2）。这些数据表明，STAT1抑制剂在防治DN方面具有重要的临床转化潜力。

图6.STAT1通过调控ELOVL5转录参与糖尿病肾病（DN）模型中的铁死亡过程

7.AARS1通过调控STAT1和H3K18的乳酸化修饰调节ELOVL5转录并触发铁死亡

   接下来，我们探究了AARS1是否影响STAT1的转录活性。数据显示，过表达AARS1可促进STAT1核转位（图7A）、增加STAT1磷酸化水平（图7B）并增强STAT1与ELOVL5启动子区域的结合（图7C）。然而，缺乏乳酸转移酶活性的AARS15M突变体[24]则无上述效应（图7A–C）。这些结果表明，AARS1可能通过调控STAT1的乳酸化修饰来增强其转录活性。

   为验证这一假设，本研究采用了体内外乳酸化修饰实验。体外乳酸化实验显示，AARS1能以浓度依赖性方式利用乳酸诱导STAT1发生乳酸化修饰（图7D）。在HGECs和HK-2细胞中也证实AARS1可诱导STAT1乳酸化（图7E）。此外，过表达AARS1能上调STAT1、H3K18la及ELOVL5的表达（图7E），并促进细胞铁死亡（补充图15），而AARS15M则无此作用（图7E；补充图15）。

   为阐明AARS1介导的STAT1乳酸化修饰对其转录功能的关键作用，我们根据文献报道[26]对STAT1的乳酸化位点进行了突变分析。数据显示，STAT1K193位点是受AARS1调控的最重要乳酸化位点（补充图16A）。更重要的是，突变STAT1K193位点可逆转AARS1过表达所诱导的STAT1核转位促进、磷酸化水平增加及与ELOVL5启动子结合增强等效应（补充图16B–D）。这些发现提示，在高糖环境中，AARS1通过催化STAT1第193位赖氨酸（K193）发生乳酸化修饰，从而增强STAT1的转录活性。综上所述，本研究证实AARS1通过调控STAT1与H3K18的双重乳酸化修饰，共同调节ELOVL5转录，进而触发DN中的铁死亡过程。

图7.AARS1通过调控STAT1和H3K18的乳酸化修饰调节ELOVL5转录并触发铁死亡

8.β-丙氨酸通过抑制AARS1诱导的乳酸化减轻糖尿病肾病模型小鼠及高糖细胞的铁死亡

   鉴于AARS1介导的乳酸化修饰在糖尿病肾病（DN）中发挥重要作用，抑制该修饰过程可能成为DN的潜在治疗靶点。前期研究表明，β-丙氨酸可通过直接与乳酸竞争结合AARS1，有效拮抗AARS1诱导的乳酸化修饰[25]。我们的体外乳酸化实验证实，β-丙氨酸确实能拮抗AARS1诱导的H3K18和STAT1乳酸化（补充图17A、B）。随后，本研究采用β-丙氨酸处理DN模型。数据显示，β-丙氨酸能以浓度和时间依赖性的方式抑制高糖诱导的高糖细胞中STAT1和H3K18乳酸化（补充图17C）。此外，β-丙氨酸处理可降低高糖细胞中AARS1、STAT1、H3K18la及ELOVL5的表达，并抑制铁死亡过程（补充图18）。与此一致的是，在DN模型小鼠中，β-丙氨酸处理能下调AARS1、STAT1、H3K18la和ELOVL5的表达（图8A–C），抑制铁死亡（图8A–F），减轻肾组织损伤（图8A），并改善肾功能障碍（补充表2）。这些数据表明，通过β-丙氨酸抑制AARS1诱导的乳酸化修饰可能成为DN的有效治疗策略。

图8.β-丙氨酸通过抑制AARS1诱导的乳酸化减轻糖尿病肾病模型小鼠及高糖细胞的铁死亡

结论：

   本研究揭示，AARS1通过催化组蛋白H3第18位赖氨酸（H3K18）和转录因子STAT1的乳酸化修饰，协同激活脂肪酸延长酶5（ELOVL5）的转录，进而促进多不饱和脂肪酸合成及脂质过氧化，最终触发铁死亡，驱动糖尿病肾病（DN）的发生与发展。抑制AARS1介导的乳酸化（如使用β-丙氨酸）或阻断STAT1活性（如使用氟达拉滨）均可有效减轻肾组织铁死亡与损伤，为DN提供了新的治疗靶点与策略。

参考文献：

Hong J, Xu H, Yu L, Yu Z, Chen X, Meng Z, Zhu J, Li J, Zhu M. AARS1-mediated lactylation of H3K18 and STAT1 promotes ferroptosis in diabetic nephropathy. Cell Death Differ. 2025 Sep 23.