METTL1 介导的 FoxO1 的 m7G 甲基化在代谢功能障碍相关脂肪肝疾病中调节脂质代谢

   代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的特点是肝细胞内脂质积累和变性，其发病机制复杂，使药物开发复杂化。在这项研究中，我们发现METTL1在MASLD小鼠的肝脏和临床样本中上调。肝细胞特异性缺失METTL1抑制脂质合成并促进脂质氧化，减轻高脂肪饮食（HFD）诱导的MASLD小鼠的代谢紊乱。相反，过表达METTL1可以促进脂质合成，同时抑制脂质氧化。m7G测序结果表明，METTL1通过甲基化FoxO1的Exon1区域来调节FoxO1 mRNA的稳定性和蛋白表达水平。此外，我们发现FoxO1的过表达抵消了METTL1缺乏对MASLD小鼠代谢紊乱的保护作用。此外，我们发现了一种有效的METTL1小分子抑制剂，HtMBm，可以显著改善HFD诱导的MASLD。总的来说，我们的研究表明METTL1在MASLD的进展中起着至关重要的作用，并强调了靶向METTL1调节这种情况下脂肪酸代谢的治疗潜力。本文于2025年10月发表于Metabolism（IF=11.9）上。

技术路线：

结果：

1）METTL1表达与脂肪肝疾病相关

   为了研究METTL1与MASLD易感性之间的关系，我们首先检测了METTL1在小鼠不同组织中的差异mRNA表达谱。我们的分析显示，METTL1主要在肝脏中表达，其次是脾脏和肾脏（图1a）。接下来，我们建立了FFAs诱导的肝细胞脂质积累模型，并采用IF和Western blot分析评估METTL1的表达。结果表明，METTL1在这种细胞脂质积累模型中高表达（图1b，c）。此外，通过qPCR和Western blot分析，我们观察到长期HFD治疗小鼠和ob/ob小鼠肝脏中METTL1的表达随着MASLD的进展而稳步增加（图1d，e）。与没有MASLD的个体相比，单纯性脂肪变性或MASH个体肝脏中的METTL1 mRNA水平显著较高（图1f）。值得注意的是，通过免疫组织化学和Western blot分析，与非MASLD组相比，MASLD组个体肝脏细胞核中METTL1的表达明显升高（图1g，h）。此外，我们观察到经FFA处理的原代人肝细胞中METTL1的表达显著增加（图1i）。总的来说，在脂肪肝中观察到的METTL1表达上调表明它可能在MASLD和MASH的进展中发挥重要作用。

2）METTL1缺乏可减轻脂肪肝疾病和代谢紊乱

   为了研究METTL1对脂肪肝疾病及其并发症的影响，我们培育了肝细胞特异性Mettl1基因敲除小鼠（Mettl1^hko），并对它们进行16周的NCD或HFD治疗。在此期间，长期监测显示，尽管与NCD相比，HFD治疗小鼠的体重和食物摄入量明显更高，但Mettl1hko和对照组（Mettl1^{fl/ fl}）小鼠在这些指标上没有显著差异（图2a，b）。然而，在HFD条件下，Mettl1的缺失显著降低了体重和肝体重比，而在NCD条件下则没有（图2c）。此外，ALT和AST水平的测量表明，Mettl1缺乏促进了HFD诱导的MASLD小鼠的肝功能恢复，而不影响NCD条件下的肝功能（图2d）。GTT和ITTs显示，肝细胞中缺乏Mettl1可显著降低胰岛素抵抗（图2e）。组织病理学分析，包括H&E和油红O染色，以及血清和肝脏TG水平的评估显示，与Mettl1^fl/fl小鼠相比，Mettl1^hko小鼠在HFD应激下表现出显着改善（图2f-h）。为了在转录组水平上系统性地评估Mettl1在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）发病机制中的作用，我们对HFD喂养的Mettl1^hko小鼠和对照Mettl1^fl/fl小鼠的肝脏组织进行了RNA-seq分析。差异表达分析显示，与对照组相比，Mettl1^hko组中有250个基因上调，286个基因下调（图2i）。GO分析进一步表明，这些差异表达基因主要与脂质代谢相关（图2j）。GSEA发现，在Mettl1^hko小鼠中，与脂质代谢相关的通路显著富集（图2k）。转录组分析的热图显示，在HFD喂养的Mettl1^hko组小鼠中，与脂质合成相关的基因表达减少（图2l）。此外，qPCR结果证实，在Mettl1缺陷小鼠的肝脏中，脂质合成相关基因（Fasn, Srebp1c, Scd1, Acaca和Fads1）的表达降低，同时参与脂肪酸氧化的基因（Acadm, Acox1和CPT1-α）表达增加（图2m）。Western blot分析进一步验证了Mettl1的缺失抑制了脂质合成，同时促进了脂肪酸氧化（图2n）。此外，FAO实验证实，在HFD条件下，Mettl1缺陷的肝脏表现出增强的脂肪酸氧化活性（图2o）。总之，这些数据表明，Mettl1的缺失通过调控参与脂质合成与氧化的基因表达从而减轻MASLD及其相关的代谢紊乱。

3）METTL1过表达加剧了MASLD小鼠的代谢异常

   为了进一步研究Mettl1在MASLD中的作用，我们通过尾静脉注射含有Mettl1基因的腺相关病毒（AAV）构建了Mettl1过表达小鼠模型。我们观察到，无论是在NCD还是HFD条件下，Mettl1过表达小鼠与对照组在体重和食物摄入量上均无显著差异（图3a，b）。然而，在HFD组中，过表达组的肝脏重量及肝重与体重比均显著高于对照组，而在NCD组中则未观察到差异（图3c）。此外，转氨酶水平检测显示，Mettl1过表达组的ALT和AST均升高，这表明Mettl1过表达损害了MASLD小鼠的肝功能（图3e）。GTT和ITT的结果表明，Mettl1过表达导致肝脏组织的胰岛素抵抗加剧（图3f）。组织病理学评估，包括 hematoxylin-伊红（H&E）和油红O染色，以及血清和肝脏甘油三酯（TG）水平的测定，均表明在HFD喂养下，与对照组相比，Mettl1过表达促进了肝脏中的脂质积累（图3d， g，h）。进一步的qPCR分析显示，在HFD诱导的小鼠中，脂质合成相关基因的表达升高，脂肪酸氧化相关基因的表达降低，并且炎症反应增强（图3i）。蛋白质印迹分析证实，Mettl1过表达刺激了脂质合成，同时抑制了脂肪酸氧化（图3j）。此外，FAO实验证实，Mettl1过表达抑制了HFD小鼠肝脏中的脂肪酸氧化（图3k）。总之，Mettl1过表达通过促进脂质合成和抑制脂质氧化，加剧了MASLD的进展。

4）METTL1调节脂肪酸诱导肝细胞的脂肪酸合成和氧化

   接下来，我们研究了METTL1对体外暴露于FFA的肝细胞脂质代谢和炎症的影响。我们构建慢病毒来降低METTL1的表达，并感染HepG2细胞系（图4a）。与对照组（shGFP）相比，在FFA处理下，METTL1缺失显著降低了脂质积累和TGs含量（图4b）。qPCR分析显示，METTL1的敲低抑制了与脂质合成和促炎反应相关的基因的表达，同时增强了与脂质氧化相关的基因的表达（图4c）。蛋白水平评估进一步证实，METTL1敲低抑制脂质合成并促进脂质氧化（图4d）。METTL1的过表达显著增强了FFA诱导的HepG2细胞中的脂质沉积，而突变体METTL1的过表达并未诱导这种作用（图4e，f）。分子分析显示，METTL1促进脂质合成和炎症反应，同时抑制脂质氧化（图4，h）。总的来说，METTL1在FFA诱导的肝脂肪变性中起关键作用。

5）METTL1调节FFAs诱导肝细胞内m7G修饰mRNA的转录组格局

   METTL1是一种稳定的m7G甲基转移酶，mRNA中内部m7G的存在强调了这种修饰的潜在功能。为了确定METTL1是否在MASLD发病过程中调控内部m7G mRNA修饰，我们对HepG2细胞在不同条件下，包括BSA/ shGFP、FFA/shGFP和FFA/shMETTL1进行了m7G MeRIP-Seq（图5a）。我们观察到m7G峰富集在shGFP组的5 ' UTR上，位于非常靠近翻译起始位点的位置。相比之下，在经FFAs处理的shMETTL1细胞中，m7G峰不太明显，主要位于编码序列（CDS）区域（图5b）。为了进一步验证m7G在整个转录本中的分布模式，我们生成了m7G内部读取的剖面，并一致发现m7G主要位于CDS区域，以及起始密码子和5 ' UTR内（图5c）。为了探究m7G修饰与基因表达之间的关系，我们将m7G峰值数据与RNA-seq基因表达数据进行了比较。我们将上调的峰分类为高甲基化的m7G峰，其中包括高下调和高上调的基因，而下调的峰被称为低甲基化的m7G峰（图5d）。随后，通过GO分析，发现m7G修饰的mRNA富集与脂质代谢相关的功能（图5e）。此外，在比较FFA/shGFP和FFA/shMETTL1细胞时，我们发现含有m7G的差异修饰mRNA在脂质代谢功能上也富集（图5f）。有趣的是，来自三种类型细胞的内部mRNA m7G的基序分析显示出对AG或GC丰富区域的相似偏好（图5g）。此外，我们分析了BSA/shGFP和FFA/shGFP之间，以及FFA/shGFP和FFA/shMETTL1之间m7G差异mRNA位点，确定了多个与脂质代谢相关的mRNA进行了m7G修饰（图5h）。这表明METTL1介导内部mRNA的m7G修饰，从而调节脂质代谢。

6）内部mRNA m7G促进FoxO1的稳定性和翻译

   我们对具有差异甲基化位点的候选mRNA进行了MeRIP-qPCR分析，然后进行了m7G-seq分析。结果表明，在HepG2细胞中，FFA/shGFP细胞中FoxO1表达升高，而FFA/shMETTL1细胞中FoxO1表达降低（图6a）。此外，小鼠肝脏的MeRIP-qPCR分析表明，喂食HFD的小鼠FoxO1表达升高，而肝细胞特异性Mettl1敲除小鼠FoxO1表达降低（图6b）。我们随后观察到shMETTL1人肝细胞和mett1^hko小鼠肝脏中FoxO1 mRNA和蛋白的表达均下降。这表明缺乏METTL1会损害FoxO1 mRNA的稳定性，导致蛋白水平降低（图6c，d）。m7G-seq分析表明FoxO1的差异m7G修饰发生在外显子1的300 bp内（图6e)。通过整合m7G位点和基序分析，我们在不改变蛋白序列的情况下，构建了人类FoxO1在G216、G333、G458和G523位点的突变质粒。研究结果显示G458突变导致FoxO1 mRNA和蛋白表达水平下降，而METTL1过表达增强FoxO1表达（图6f）。此外，我们使用过表达WT FoxO1和G458突变FoxO1的HepG2细胞进行了代谢特性分析。G458突变显著降低了FoxO1的RNA和蛋白表达水平（图6小时）。Nile Red染色和TG分析显示FoxO1 G458突变体减少了脂质积累（图6g）。此外，G458突变抑制了脂质合成相关基因的表达，同时增强了脂质氧化相关基因的表达（图6i，j）。这些数据表明FoxO1介导的脂质合成和氧化是通过METTL1介导的m7G修饰在人G458/小鼠G449外显子1位点进行调控的。

7）FoxO1过表达抵消了METTL1缺乏对MASLD脂质代谢紊乱的保护作用

   接下来，我们利用AAV在Mettl1^fl/fl和Mettl1^hko小鼠的肝脏中过表达FoxO1，评估其对Mettl1缺乏对MASLD的保护作用的调控作用。虽然FoxO1-过表达小鼠的摄食量与其他组没有显著差异，但在HFD喂养16周后，它们的体重大于感染GFP病毒的对照组（图7a，b）。然而，过表达FoxO1显著增加肝脏重量和肝体重比（图7c）。此外，FoxO1过表达降低了Mettl1缺乏对MASLD小鼠胰岛素抵抗的保护作用（图7d）。肝转氨酶检测显示FoxO1过表达会升高转氨酶水平，从而损害肝功能（图7e）。组织学染色和TG分析显示，Mettl1^hko小鼠的肝脏脂质积累明显低于Mettl1^fl/fl小鼠，而FoxO1过表达显著增加了肝脏脂质积累（图7f，g，h）。随后，我们检测了肝组织中脂质合成和氧化相关基因的表达。结果显示FoxO1过表达抵消了Mettl1缺乏对脂质代谢的影响（图7i，j）。此外，FAO实验表明FoxO1过表达可以抑制METTL1缺乏引起的脂质氧化增加（图7k）。综上所述，Mettl1缺乏对MASLD脂质代谢失调的保护作用是通过调节FoxO1的表达来介导的。

8）METTL1抑制剂对HFD诱导的MASLD有保护作用

   为了确定潜在的METTL1抑制剂，我们对Chemdiv2019数据库进行了基于结构的虚拟筛选，该数据库包含1,535,478种药物样化合物。从这次筛选中，我们选择了在METTL1的催化口袋中表现出最高对接分数的前10个候选化合物，最后确定HtMBm。为了进一步研究HtMBm在MASLD中的作用，我们通过HFD小鼠腹腔注射HtMBm建立了脂肪肝模型（图8b）。我们观察到，HtMBm治疗组的体重、肝脏重量、肝脏体重比和摄食量均略低于对照组（图8c，d，e）。肝转氨酶水平显示，HtMBm治疗组ALT和AST均降低，提示肝功能改善（图8f）。此外，GTT和ITT表明，HtMBm治疗可改善肝组织的胰岛素抵抗（图8g）。组织病理学评估，包括H&E和油红O染色，以及血清和肝脏TG水平的测量，表明HtMBm治疗组与对照组小鼠相比，肝脏中的脂质积累减少（图8h，i，j）。使用qPCR的进一步分析显示，脂质合成相关基因的表达减少，脂肪酸氧化相关基因的表达增加，炎症反应减少（图8k）。Western blot分析证实，HtMBm处理刺激脂质氧化，同时抑制脂质合成（图8l）。这些发现表明，HtMBm通过靶向METTL1抑制脂质合成和促进脂质氧化来改善MASLD的进展。

结论：

   本研究详细了解了METTL1在MASLD发展中的功能和潜在的分子机制。这些发现为开发m7G修饰靶向治疗MASLD的临床治疗提供了有价值的见解。

参考文献：

Du J, Li Y, Zhu X, Gao J, Zhang Y, Wang C, Han D, Qiao L, Kou B, Guo R, Zhang H, Lin J. METTL1-mediated m7G methylation of FoxO1 regulates lipid metabolism in metabolic dysfunction-associated fatty liver disease. Metabolism. 2025 Oct 14;174:156420. doi: 10.1016/j.metabol.2025.156420.