肿瘤源性外泌体LINC01812诱导M2巨噬细胞极化促进胆管癌的神经周围浸润

         M2型巨噬细胞在侵袭性实体瘤的肿瘤微环境中发挥着关键作用。它们与神经周围浸润（PNI）密切相关，且常与不良预后相关联。在此背景下，肿瘤源性外泌体是细胞间通讯的重要介质。然而，肿瘤细胞诱导的M2型巨噬细胞与胆管癌中的PNI之间的关系尚未得到探究。在本研究中，我们运用多重免疫荧光和转录组测序技术，证明了LINC01812在胆管癌组织中表达上调，且其与M2型巨噬细胞浸润呈正相关。外泌体lncRNA测序、外泌体摄取实验、RNA下拉实验以及质谱分析表明，巨噬细胞能够摄取含有LINC01812的外泌体，并促进胆管癌细胞向M2型表型转化。此外，肿瘤微环境可通过M2型巨噬细胞显著增强胆管癌细胞的神经浸润能力。本研究结果表明，源自胆管癌的含LINC01812的外泌体可诱导M2型巨噬细胞极化，并促进神经浸润，从而为治疗胆管癌中的PNI提供了新的潜在治疗靶点。本文于2025年3月发表于“Cancer Letters”（IF=9.1）上。

技术路线：

结果：

1）CCA不同浸润阶段M1/M2巨噬细胞密度

         我们采用多重荧光染色技术，检测了CD68、iNOS和CD206之间的关系。结果显示，M1型巨噬细胞呈广泛阳性信号，且在腺体组织中显著聚集。相比之下，M2型巨噬细胞在肿瘤侵袭前沿的微环境中分布更为弥散。为验证免疫荧光染色结果，我们对iNOS和CD206的荧光强度与细胞密度进行了定量分析。结果表明，与邻近正常组织相比，肿瘤组织中iNOS的荧光强度和M1型巨噬细胞的密度均显著降低，而CD206的荧光强度和M2型巨噬细胞的密度则显著升高（图1A）。随后，我们对12例胆管癌（CCA）患者的样本进行了全转录组测序。我们与exoRbase数据库进行了联合分析，并鉴定出76个差异上调的差异表达基因（DEGs）（图1B和C）。其中，LINC01812尤为引人关注，因为它在胆管癌组织中的表达显著升高，且在胆管癌患者来源的外泌体中富集，提示其在肿瘤-免疫细胞通讯中可能发挥作用。我们观察到LINC01812的表达与M2型巨噬细胞浸润呈正相关，与M1型巨噬细胞水平呈负相关，这支持了其可能参与免疫细胞分化和功能调节（图1D）。此外，我们利用公共数据库验证了LINC01812与M2型巨噬细胞之间的正相关性（图1E）。此外，我们证实了LINC01812高表达患者的基质评分和ESTIMATE评分显著高于LINC01812低表达患者（图1F）。基于这些结果，我们选择LINC01812进行进一步研究，以阐明其在胆管癌中的功能作用和分子机制。

2）THP-1细胞外泌体的分离、表征和摄取

         TEM图像显示，外泌体呈现出典型的杯状形态（图2A）。NTA显示，分离得到的外泌体的平均直径约为110 nm，与典型外泌体的特征一致（图2B）。Western blot实验证实了外泌体标志物（包括Alix、HSP70、TSG101、CD81）以及阴性标志物calnexin的表达（图2C）。共聚焦显微镜显示，随时间推移，积累在THP-1细胞周围的外泌体数量显著增加（图2D）。用于分析外泌体中LINC01812表达的exoRbase数据库显示，其在胆汁、食管鳞状细胞癌和黑色素瘤中的表达水平升高（图2E）。此外，肿瘤患者血液、尿液和胆汁样本中的LINC01812表达显著高于健康对照组（图2F）。

3）LINC01812促进CCA细胞的增殖、迁移和侵袭

         为探究LINC01812在CCA中的功能作用，我们首先评估了其在HIBEPIC、HUCCT1、QBC939、RBE和HCCC9810细胞中的表达水平（图3A）。根据qPCR分析结果，选择RBE细胞系进行LINC01812敲低实验，并利用慢病毒载体在HUCCT1细胞中建立了LINC01812的稳定过表达细胞系（图3B和C）。CCK-8和EdU实验结果显示，LINC01812敲低显著抑制了RBE细胞的增殖（图3D和E）。划痕愈合实验和Transwell实验进一步表明，LINC01812敲低显著降低了CCA细胞的迁移和侵袭能力（图3F和G）。流式细胞术结果显示，LINC01812敲低后细胞凋亡显著增加。相反，在HUCCT1细胞中过表达LINC01812则产生了与敲低相反的效果；LINC01812过表达显著促进了细胞增殖（图3D）、迁移和侵袭（图3F和G）；此外，还降低了细胞凋亡率。

4）CCA细胞外泌体衍生的LINC01812诱导M2巨噬细胞极化，促进肿瘤进展

         通过FISH技术检测了LINC01812在CCA细胞和巨噬细胞中的亚细胞定位。结果显示，LINC01812主要定位于细胞质中（图4A）。采用Transwell共培养模型将HUCCT1细胞与M0型巨噬细胞共培养（图4B和D）。与LINC01812过表达的HUCCT1细胞共培养后，M0型巨噬细胞的迁移能力显著增强。Western blot分析证实，在此共培养条件下，M0型巨噬细胞发生了M2型极化（图4C）。仅与外泌体共培养的结果显示，Lenti-oe-LINC01812-exo显著诱导M0型巨噬细胞分化为M2型而非M1型巨噬细胞（图4E和G）。此外，添加外泌体抑制剂GW4869显著抑制了CCA细胞来源的外泌体诱导的M0型巨噬细胞极化。qPCR证实，M2型巨噬细胞中LINC01812的表达显著上调（图4F）。在裸鼠皮下成瘤实验中，研究了外泌体来源的LINC01812在CCA体内的作用（图4H）。结果显示，与NC-exo组相比，Lenti-oe-LINC01812-exo组的肿瘤体积和重量显著增加；而NC-exo组的肿瘤大小和重量相对于PBS组也显著增加（图4I、J、4K）。

5）外泌体LINC01812通过与TUBB4B相互作用促进M2巨噬细胞极化

         我们使用生物素标记的LINC01812探针或阴性对照（NC）探针与来自THP-1 M0型巨噬细胞的总蛋白提取物进行孵育，以探究LINC01812的作用机制。利用链霉亲和素磁珠进行下拉分析后，通过SDS-PAGE分离蛋白产物（图5A）。采用质谱（MS）技术鉴定LINC01812结合蛋白，并选取至少两条独特鉴定的肽段进行进一步分析。候选蛋白包括TUBB4B、CNBP、RPF1、DDX54、PGAM2和HSPD1。利用基因表达综合数据库的单细胞数据对肿瘤微环境（TME）中的巨噬细胞浸润情况进行表征。首先，将所有细胞聚类为六个亚群（图5D），并将髓系亚群进一步重新聚类为单核细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞（图5E）。随后，我们分析了重新聚类的巨噬细胞亚群中TUBB4B、CNBP、RPF1、DDX54、PGAM2和HSPD1的表达水平。结果显示，与邻近组织相比，TUBB4B和HSPD1在癌组织中显著高表达，而PGAM2的表达无显著差异。因此，我们对剩余五个基因进行了拟时序分析。拟时序分析用于模拟CCA中髓系细胞的分化过程（图5G和H），结果显示单核细胞处于分化的早期阶段；经过分支点4后，它们逐渐分化为M1型和M2型巨噬细胞。随后，我们分析了这些结合蛋白在M2型巨噬细胞分化拟时序轨迹上的表达趋势（图5I）。结果表明，TUBB4B是LINC01812调控M2型巨噬细胞分化过程中的关键基因。分析了TUBB4B高表达组和低表达组之间的配体-受体介导的细胞相互作用（图5J）。Western blot分析验证了TUBB4B与LINC01812之间的相互作用（图5C），二级质谱图如图5B所示。

6）外泌体LINC01812通过结合TUBB4B调控Notch通路

         与邻近的非癌组织相比，在12例CCA样本和TCGA数据库的肿瘤组织中，LINC01812和TUBB4B均显著上调（图6A）。在TCGA-CHOL队列中，LINC01812的高表达与较差的总生存率相关；然而，TUBB4B的表达并未显示出显著的预后差异（图6B）。随后，我们进行了原位杂交和双重免疫荧光染色，以确定LINC01812和TUBB4B在CCA组织中的共定位情况。我们还使用免疫荧光技术分析了TUBB4B和M2型巨噬细胞极化标志物CD206的定位情况。结果显示，LINC01812和TUBB4B在肿瘤组织中共定位（图6C）。然而，由于CD206在肿瘤组织中广泛分布，TUBB4B与CD206的共定位并不显著。这些发现表明LINC01812和TUBB4B的表达水平之间可能存在相关性。对来自患者的40例CCA组织样本进行的qPCR验证了这些结果（图6E）。在THP-1 M0型巨噬细胞中过表达LINC01812可增加TUBB4B的表达（图6D）。我们用放线菌素D处理了LINC01812过表达和敲低的M0型巨噬细胞，以探究LINC01812在调控TUBB4B中的作用。如图6F所示，在放线菌素D处理下，LINC01812过表达显著增加了TUBB4B的mRNA表达。相反，在相同实验条件下，LINC01812的敲低导致TUBB4B表达显著降低（图6F）。利用siRNA转染THP-1来源的M0型巨噬细胞，以敲低TUBB4B。转染48小时后，进行RNA测序分析，鉴定出1626个差异表达基因（DEGs）（图6G）。GSEA显示，在TUBB4B过表达组中，Notch通路基因集的表达水平较高（图6H）。Western blot分析显示，与NC组相比，在Lenti-oe-LINC01812过表达组中，TUBB4B和Notch通路成分（包括c-Myc、Hes1、Notch1和Notch3）的表达显著增加（图6I）。LINC01812诱导的Notch通路激活依赖于TUBB4B的表达，且敲低TUBB4B可有效阻断LINC01812诱导的Notch通路激活。这表明LINC01812与TUBB4B之间存在线性调控轴（图6J）。最后，流式细胞术显示，与NC组相比，用Lenti-oe-LINC01812-exo处理的M0型巨噬细胞显著向M2表型分化；然而，在M0型巨噬细胞中敲低TUBB4B显著抑制了Lenti-oe-LINC01812-exo的作用（图6K）。

7）外泌体LINC01812通过诱导M2巨噬细胞极化促进PNI

         外泌体可被神经元细胞摄取，并影响特定神经营养因子的分泌。因此，我们评估了在不同处理条件下PC12细胞的分化水平以及四种特定神经营养因子的分泌情况。外泌体可促进低分化PC12细胞的分化，而Lenti-oe-LINC01812-exo可进一步增强这种效果。与M2型巨噬细胞共培养可放大分化效应，使分化水平显著升高（图7A）。qPCR结果显示，与NC-exo处理组相比，经Lenti-oe-LINC01812-exo处理的PC12细胞中神经营养因子的分泌水平略有增加，尽管差异无统计学意义；然而，当PC12细胞与M2型巨噬细胞共培养时，这种效应显著增强（图7B）。我们建立了体外CCA周围神经浸润（PNI）模型，通过观察CCA细胞在基质胶中的迁移情况，进一步探索外泌体的作用。外泌体可促进CCA细胞向背根神经节（DRG）的侵袭。与M2型巨噬细胞共培养可显著增强这种侵袭能力，而预先用GW4869处理CCA细胞则可有效抑制这一过程（图7C）。这表明外泌体LINC01812和M2型巨噬细胞可以通过独立和协同机制促进PNI。TCGA-CHOL数据显示，PNI患者的LINC01812表达水平显著升高（图7D）。在确认巨噬细胞中的Notch通路可被外泌体LINC01812激活后，我们进行了ELISA以测量巨噬细胞上清液中CCL2的表达水平。经Lenti-oe-LINC01812-exo处理后，CCL2表达增加了约五倍。相比之下，经NC-exo处理的巨噬细胞中CCL2表达仅增加了1.6倍，这可能是由于其他补偿机制对CCL2的调控所致（图7E）。此外，本研究的作用机制示意图如图7F所示。

结论：

         本研究证明，CCA细胞来源外泌体可通过LINC01812-Notch-CCL2轴介导M2型巨噬细胞极化并促进神经浸润。这一过程形成了有利于肿瘤侵袭的免疫微环境，并突显了LINC01812作为胆管癌神经浸润预测生物标志物的潜力。

实验方法：

         qPCR，CCK8，伤口愈合试验，Transwell，流式，FISH，Western blotting，RNA pull-down。

参考文献：

         Wang Q, Sun Z, Guo J, Li H, Zhang J, Zhang B, Zhou B, Feng Y. Tumor-derived exosomal LINC01812 induces M2 macrophage polarization to promote perineural invasion in cholangiocarcinoma. Cancer Lett. 2025 May 1;617:217596. doi: 10.1016/j.canlet.2025.217596.