Kremen2通过阻止SOCS3介导的EGFR降解来驱动非小细胞肺癌的进展

       肺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡率的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的85%。NSCLC患者临床预后较差，总体5年生存率为15%。靶向治疗的出现使NSCLC的治疗取得了显著进展，然而患者不可避免地会出现耐药。因此，需要基于生物标志物的新靶点。Kremen2是一种由473个氨基酸组成的单跨膜结构域蛋白，是经典Wnt信号通路的重要调节因子。有研究报道，根据癌症基因组图谱（TCGA）分析，在来自18种不同癌症类型的70%以上组织样本中，肿瘤组织中的Kremen2表达水平显著高于配对的正常组织，尤其是在Kremen2表达水平比高10倍以上的鳞状肺癌中。然而，其在NSCLC中的生物学功能和临床意义尚不明确。表皮生长因子受体（EGFR）是一种受体酪氨酸激酶，是目前公认的治疗NSCLC的有效靶点。EGFR的异常活化被认为是恶性转化和肿瘤转移的主要原因。多种机制可诱导EGFR的致癌激活，如基因突变、转录过表达和EGFR降解缺陷。多项研究表明，EGFR的稳定性是调节肺癌进展的重要决定因素，EGFR降解失调加速了肿瘤的发生和进展。SOCS蛋白家族是众所周知的细胞因子受体信号转导的负调控因子。SOCS3是SOCS蛋白家族的成员，通过抑制JAK/STAT信号通路发挥肿瘤抑制作用。敲除SOCS3会破坏E3连接酶复合物的形成，并驱动整合素β1介导的小细胞肺癌转移。在之前的研究中，SOCS3主要是基于其甲基化沉默导致功能丧失而在NSCLC中进行评估。该研究发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。
技术路线

主要研究结果
1. Kremen2在非小细胞肺癌中表达上调，并与不良预后相关
       为了寻找新的与NSCLC相关的致癌基因，作者在TCGA数据库中检索了504例有病理信息的肺腺癌样本，并筛选出57对配对的非癌和癌样本。进一步分析这些配对患者样本的RNA-seq结果，并使用一般线性模型（P<0.05）筛选差异表达基因（DEGs）（图1A）。分析显示，Kremen2的表达存在显著差异，这在肺癌中尚未被研究过。此外，比较每对TCGA样本的原始Kremen2 RNA-seq数据后，肿瘤组织中的Kremen2表达水平较高（图1B）。采用GEPIA软件分析Kremen2在NSCLC中的表达。结果显示，与癌旁正常肺组织相比，在NSCLC组织中，尤其是肺鳞状细胞癌组织中，Kremen2表达显著上调（图1C）。
为了评估Kremen2在NSCLC临床标本中的表达，作者检测了新鲜冷冻的NSCLC标本及其配对的正常组织中Kremen2 mRNA的水平。结果显示，与正常组织相比，NSCLC组织中Kremen2 mRNA水平显著升高（图1D）。蛋白质印迹法检测到大多数NSCLC标本中Kremen2蛋白水平升高（图1E）。免疫组织化学染色进一步显示，肿瘤组织中Kremen2高表达（图1F）。此外，作者检测了一些NSCLC细胞系中的Kremen2蛋白水平，发现在NSCLC细胞中Kremen2蛋白表达普遍较高（图1G）。
       为了阐明Kremen2过表达与NSCLC患者生存的相关性，作者使用Kaplan-Meier plotter数据库分析NSCLC病例。结果如图1H和I所示，表明高Kremen2表达水平的NSCLC患者与较差的总生存期（OS）相关，如较低的OS和首次进展生存期（P<0.05）。卡方检验显示，Kremen2表达上调与原发肿瘤（T）分期（P=0.041）和病理分级（P=0.045）相关。综上所述，这些数据表明，Kremen2在NSCLC中过表达，并且Kremen2过表达可能与患者的不良预后相关。

图1 Kremen2在非小细胞肺癌中表达上调，并与不良预后相关

2. 沉默NSCLC细胞中Kremen2表达可抑制细胞增殖
       为了研究Kremen2在NSCLC中的生物学功能，作者利用CRISPR/Cas9方法产生敲除Kremen2的A549细胞（A549-krm2ko），其中插入胸腺嘧啶残基导致移码突变。通过克隆形成实验和EdU掺入实验检测Kremen2对A549和A549-krm2ko细胞增殖的影响。A549-Krm2KO细胞的克隆形成能力低于野生型细胞（图2A），EdU阳性细胞显著减少，表明细胞增殖能力下降，而在A549-Krm2KO细胞中过表达外源性Flag-Kremen2（Flag-Krm2）时，edu阳性细胞比例增加（图2B），证实了Kremen2对细胞增殖的影响。此外，作者利用慢病毒介导的shRNA沉默内源性Kremen2表达，建立了稳定沉默Kremen2的NSCLC细胞株。同样，A549和H1703细胞（shKrm2）中的Kremen2敲低抑制了集落形成和细胞增殖能力（图2D-F）。通过皮下注射稳定敲低Kremen2的A549细胞建立裸鼠移植瘤模型，验证这些体外发现是否与体内肿瘤生长相关。在A549异种移植模型中获得了一致的结果，敲低Kremen2的表达显著抑制了肿瘤的大小和重量（图2G-I）。IHC染色显示，由于A549细胞的Kremen2敲低，A549种植小鼠组织中的ki67阳性细胞百分比较低（图2J）。综上所述，这些数据表明，Kremen2在NSCLC细胞生长中发挥重要作用。

图2 沉默NSCLC细胞中内源性Kremen2表达可抑制细胞增殖

3. Kremen2高表达促进NSCLC细胞转移
       临床资料显示，Kremen2的表达与LUAD患者病理分级呈正相关，提示Kremen2可能参与了肿瘤的转移。为了解决这一问题，作者检测了体内外Kremen2对肿瘤细胞转移能力的影响。Transwell实验结果显示，在A549细胞中，敲除Kremen2可减弱细胞的侵袭能力，而在A549-krm2ko细胞中过表达Flag-Krm2可增强细胞的侵袭能力（图3A）。同样，通过shRNA下调Kremen2表达后，H1703和A549细胞的侵袭数量减少（图3B，C）。此外，来自伤口愈合实验的数据表明，敲低Kremen2降低了细胞迁移（图3D-G）。通过实时荧光定量PCR检测沉默Kremen2后NSCLC细胞中上皮-间充质转化（EMT）标志物的变化，探讨其对NSCLC细胞EMT的抑制作用。Kremen2敲低和低pro-EMT Snail1和Twist1水平之间存在明显的正相关。为了进一步了解Kremen2在体内是否促进肿瘤转移，作者对A549-Krm2KO细胞和A549-Krm2KO + OE-Krm2细胞（A549-Krm2KO细胞过表达Kremen2）进行了尾静脉转移实验。结果显示，删除Kremen2减少了肺转移结节的数量，而过表达Kremen2显著增加了肺转移结节的数量（图3H-J）。为了更好地观察肺内转移结节的形成，作者在A549细胞中构建了共表达GFP的shCtrl和shKrm2细胞，观察细胞的荧光强度（图3K和L）。将两种表达GFP的细胞注射到裸鼠尾静脉。HE染色和荧光信号结果显示，在A549细胞中下调Kremen2与对照组相比，肺转移结节数量减少（图3M-O）。综上所述，这些发现表明，Kremen2是NSCLC转移的促进因子。

图3 体内外实验显示，Kremen2促进NSCLC细胞转移

4. Kremen2参与多种癌症相关信号通路
       为了阐明Kremen2促进肺癌发生的机制，采用RNA-seq比较H1703细胞中对照组和Kremen2敲低（shKrm2）组的转录组变化。根据表达的倍数变化（≥1或≤-1），shKrm2组中共鉴定出273个上调基因和281个下调基因。对上调和下调基因进行层次聚类分析（图4A）。GO分析表明，DEGs与细胞增殖、发育、运动和迁移密切相关（图4B）。KEGG富集分析表明，这些DEGs富集在与癌症相关的信号通路，如MAPK、Wnt和PI3K-AKT信号通路（图4C）。由于之前的Kremen2研究多集中在Wnt信号通路，作者首先检测到了Wnt信号通路中关键蛋白表达的变化。蛋白质印迹结果显示，敲低Kremen2并没有显著影响β-catenin蛋白水平，但增加了H1703细胞中LRP6的总蛋白和磷酸化水平（图4D），可能是由于LRP6的内吞降解减少。此外，在H1703细胞中敲低Kremen2后，PI3K（Y607）和AKT（Ser473）的磷酸化水平显著下调（图4E），这与在胃癌中对Kremen2的研究结果一致。
       由于STAT3信号通路的激活已经在相当比例的NSCLC病例中被报道，作者也测试了Kremen2是否调节STAT3信号通路。蛋白质印迹结果显示磷酸化JAK2（Y1007和Y1008）和STAT3（Y705）水平下调，而总JAK2和STAT3水平无变化。与此同时，STAT3通路中负责调节细胞增殖的下游因子c-Myc和Cyclin D1蛋白水平也显著降低（图4F和G）。相反，过表达Kremen2增强了p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白水平（图4H），表明Kremen2影响了JAK2-STAT3信号通路。

图4 抑制Kremen2参与多种癌症相关信号通路

5. Kremen2通过稳定EGFR促进NSCLC细胞增殖
       考虑到EGFR是JAK2-STAT3和PI3K-AKT信号通路的上游共同激活因子，在NSCLC的进展中发挥重要作用，作者将从shKrm2 H1703细胞中筛选的DEGs输入FunRich软件进行功能分析。结果显示大多数基因聚集在EGFR相关通路上。然后，作者检测了Kremen2是否影响EGFR蛋白水平。蛋白质印迹结果表明，siRNA介导沉默Kremen2可下调A549和H1703细胞中的EGFR蛋白水平（图5A）。在Kremen2稳定敲低的细胞中，EGFR蛋白水平也降低，而过表达Kremen2增加了EGFR蛋白水平（图5B）。作者在A549-Krm2KO细胞中获得了类似的结果。将Flag-tagged Kremen2重新引入A549-Krm2KO细胞中可恢复EGFR蛋白水平（图5C）。如图5D所示，蛋白酶体抑制剂MG132逆转了Kremen2敲除细胞中EGFR蛋白水平的下降，表明Kremen2可能通过蛋白酶体降解来调节EGFR蛋白水平。作者进一步研究了敲低Kremen2是否影响EGF刺激后EGFR的磷酸化。结果显示，沉默Kremen2降低了A549和H1703细胞中EGF诱导的EGFR、STAT3和AKT的磷酸化（图5E）。为了评估Kremen2是否通过调节EGFR促进细胞增殖，作者在过表达Kremen2的A549细胞中去除内源性EGFR，观察到抑制内源性EGFR的表达减弱了Kremen2诱导的细胞增殖（图5F）。相反，在Kremen2敲低的A549细胞中过表达EGFR表明外源性EGFR表达促进了Kremen2敲低细胞的增殖（图5H）。综上所述，这些数据表明，在NSCLC中，Kremen2的高表达水平可能通过维持EGFR的稳定性促进肿瘤进展。

图5 Kremen2通过促进EGFR的稳定促进NSCLC细胞增殖

6. Kremen2和SOCS3的相互作用可抑制EGFR的泛素化和降解
       为了了解Kremen2是如何调控EGFR的，作者使用co-IP来下调参与EGFR信号通路的Kremen2相互作用蛋白。令人惊讶的是，Kremen2不与EGFR、AKT或STAT3蛋白相互作用，但与STAT3信号通路的负调控因子SOCS3强相关（图6A）。此外，在A549细胞（图6B）中观察到内源性Kremen2和SOCS3共定位。在变性条件下纯化外源性SOCS3，然后对Kremen2进行免疫印迹分析，证实了Kremen2和SOCS3之间的相互作用（图6C）。接下来，作者分别在A549和A549-oe-krm2细胞中过表达SOCS3，以探索SOCS3在Kremen2和EGFR之间关系中的作用。如图6D所示，过表达外源性SOCS3降低了A549细胞中EGFR蛋白水平和STAT3的磷酸化水平，而稳定过表达Kremen2部分逆转了这一现象（图6D）。
       此外，SOCS3过表达细胞中EGFR水平的下降被蛋白酶体抑制剂MG132逆转，表明SOCS3通过蛋白酶体降解调节EGFR水平（图6E）。为了进一步研究SOCS3是如何调控EGFR的，作者用cicloheximide处理细胞并检测EGFR的半衰期。结果表明，过表达SOCS3可缩短EGFR蛋白的半衰期（图6F）。接下来，作者对内源性蛋白进行了相互共IP。正如预期的那样，内源性SOCS3与EGFR相互作用（图6G），而内源性EGFR与SOCS3结合（图6H）。这些结果表明SOCS3可以与EGFR结合并促进细胞中EGFR的降解。
       据报道，SOCS3可促进TBK1和整合素β1的泛素化和降解；因此，作者接下来研究了SOCS3对EGFR泛素化的影响。结果，与对照组相比，在A549细胞中过表达SOCS3增加了EGFR的多泛素化（图6I）。为了进一步研究Kremen2是否影响SOCS3介导的EGFR泛素化，作者进行了体外泛素化实验。在HEK293T细胞中，Flag-SOCS3和His-EGFR共表达，在变性条件下纯化His-EGFR，随后对EGFR进行免疫印迹分析，证明在SOCS3过表达细胞中外源性EGFR泛素化增加，而Kremen2过表达导致SOCS3对EGFR的多泛素化减少（图6J）。
       综上所述，这些数据表明，Kremen2与SOCS3相互作用，并通过阻止SOCS3介导的EGFR泛素化和降解来稳定EGFR蛋白；从而增强EGFR信号通路的活化，促进NSCLC细胞的增殖和转移。

图6 Kremen2与SOCS3的相互作用抑制EGFR的泛素化和降解

结论
       该研究证明了Kremen2在NSCLC肿瘤发生中的新作用。机制上，Kremen2可能通过与SOCS3相互作用，阻断泛素依赖的EGFR降解，从而维持EGFR介导的肿瘤信号通路，促进NSCLC细胞的增殖和转移。因此，Kremen2可能成为NSCLC新的治疗靶点。
机制图

实验方法
免疫组织化学（IHC），菌落形成和EdU测定，流式细胞术，Transwell和伤口愈合测定，定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），蛋白质印迹，免疫沉淀，免疫荧光，动物实验
参考文献
Sun Y, Gao Y, Dong M, Li J, Li X, He N, et al. Kremen2 drives the progression of non-small cell lung cancer by preventing SOCS3-mediated degradation of EGFR. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 3;42(1):140.