NLRP3和钙离子积累共同推进类风湿性关节炎进程

    增加细胞外Ca2+浓度（[Ca2+] ex）在单核细胞内通过钙离子敏感受体（CaSR）驱动激活NLRP3炎症小体。但是在类风湿性关节炎中的具体机制仍不清楚，本文对该机制进行了深入探讨，并挖掘出重要的代谢通路。本文在2020年8月25日发表在《Nature Communications》期刊上，其影响因子12.121。

研究结果：
1、[Ca2+] ex的增加导致钙蛋白颗粒（CPPs）的形成
    为了探究钙离子敏感受体（CaSR）驱动的骨髓细胞内导致NLRP3依赖的IL-1β产量，构建了CaSR敲除的单核细胞THP-1细胞系。如Fig. 1a所示，[Ca2+] ex诱导的IL-1β响应在CaSR敲除的单核细胞THP-1细胞中被显著抑制，而对ATP和尿酸一钠(MSU)晶体的响应不受影响。用小鼠外周血单核细胞进行骨髓特异性CaSR敲除(B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo7jx-CaSRΔflox/Δflox)实验证实了这种CaSR效应，研究发现，在5.6mM [Pi]ex存在的情况下，经[Ca2+]ex刺激后，IL-1β分泌物分泌显著减少(Fig.1b)。
    使用含有1-5.6mM的Pi的RPMI1640培养基，研究Pix对[Ca2 +] ex诱导的单核细胞中IL-1β释放的影响，其中加入[Ca2 +]作为氯化钙作用。在≥3mM的Piex下，[Ca2 +] ex触发的IL-1β释放增加具有浓度依赖性（Fig.1c）。在低Piex下没有[Ca2 +] ex效应，而且高Piex与低[Ca2 +] ex结合也不会诱导IL-1β释放（Fig.1c）。如Fig.1d所示，CPPs只能在≥3mM的Pix情况下检测到，且在没有[Ca2 +]的情况下不形成钙离子颗粒。孵育20小时后，CPPs的大小仅略有增加，与颗粒形成并行，由于Ca 2+在颗粒中的结合，[Ca 2+]逐渐降低，通过此过程，添加的Ca2 +会在20h内完全用完（Fig.1e）。WB可以检测到CPPs中确实存在胎球蛋白（Fig.1f），其颗粒形态为非晶体的，无固定性状的，胶体结构（Fig.1g和h）。电子显微镜与能量色散x射线能谱(EDX)结合揭示在最初的4小时内，CPPs钙和磷的含量大致相等。

Fig. 1 In the presence of [Pi] and fetuin-A, addition of [Ca2+] triggers calciprotein particle formation

    为了证实被[Ca2+]刺激的单核细胞中CPPs的存在，使用TEM和扫描透射电镜(STEM)，可以看到靠近细胞表面的细胞外间隙中有电子致密颗粒，胞浆中也有(Fig. 2a, b)。颗粒的大小和元素组成与FBS补充的2.5mM [Ca2 +]的RPMI中检测到的CPP相一致，EDX分析表明，这些颗粒含有大量的Ca2 +，表明它们的大小和组成与上述CPP确实相同（Fig.2c，d）。

Fig. 2 Uptake and elemental composition of intracellular calciprotein particles

2、CPPs被CaSR介导的大胞饮作用吸收
    增加[Ca2 +] ex刺激大胞饮作用，所以作者猜测自发形成的CPP可能被单核细胞吞噬由于[Ca2 +] ex诱导的CaSR信号，于是作者使用流式细胞术检测单核细胞的大胞饮作用。如Fig.3a, b所示，单核细胞的大胞饮作用是以一种剂量依赖的方式受到[Ca2 +] ex调节，而不是依赖于[Pi]ex。此外，[Ca2 +] ex诱导的钙离子大胞饮吸收是一个主动耗能的过程，其37℃时的效果强烈，4℃时则被抑制，并且该过程可以通过细胞松弛素D或latrunculin A（两种肌动蛋白聚合抑制剂）预处理废除掉（Fig.3c-e）。鉴于Calhex231和NPS2143，两种CaSR的特异性负变构调节器可以抑制单核细胞大胞饮作用，证实了[Ca2 +] ex诱导的单核细胞大胞饮作用确实是受到CaSR信号驱动（Fig.3f）。
    为了确认[Ca2 +] ex诱导的胞内CPPs的摄取用共焦拉曼显微镜(CRM)对单核细胞进行了实时成像(CRM, Fig. 3g, h)。CPPs在无细胞介质中的拉曼光谱(Fig. 3h，左)显示了与羟基磷灰石晶体颗粒高度相似的指纹图谱。孵育60min后，CPPs在细胞膜附近被发现，并内化在单核细胞中（Fig.3g）。从胞内CPPs提取的拉曼光谱(Fig. 3h，右)显示胞内PO4 - 3振动存在对称的拉伸和弯曲模式。这些都证实了单核细胞中[Ca2 +] ex诱导的CPPs的被摄取进入细胞。

Fig. 3 [Ca2+] ex induces macropinocytosis

    接下来，使用流式成像观察大胞饮作用吸收CPPs通过将单核细胞与结合Ca2+的荧光染料共孵育。荧光图中细胞内钙离子信号即表示CPPs的积累。如Fig.4a所示，2.5mM [Ca2+]ex驱动单核细胞对CPPs的吸收，若没有[Ca2+]ex则吸收量极少。当使用另一种CaSR级联的物质钡代替[Ca2+]ex的时候也能观察到类似的CPPs吸收(Fig. 4b)。
    [Ca2+]ex诱导的和[Pi]ex诱导的响应曲线显示对照组细胞中添加1mM [Ca2+]时有快速的细胞反应，在CaSR缺乏的THP-1细胞中响应显著降低(Fig. 4d)。然而，CaSR缺乏的细胞仍然对[Ca2+]的添加表现出一些反应，很可能是由于CaSR的独立作用。[Ca2+]ex诱导的和[Pi]ex诱导的动态质量重新分配(DMR)响应显示Ca2+加入后的30min开始二次缓慢增加，单核细胞DMR对增加的[Ca2+]ex的响应受到[Pi]ex的与浓度相关的信号增强的影响(Fig. 4e)。

Fig. 4 Macropinocytosis of CPPs depends on CaSR signaling.

3、IL-1β被CPPs和[Ca2+]ex 触发是不依赖[Pi]ex的
    为了探究CPPs在[Ca2+]ex 诱导的NLRP3炎症小体激活中的作用，在低浓度[Pi]培养基中，在预先形成的CPPs存在的情况下，用[Ca2+]ex刺激单核细胞，以排除从头形成CPPs的可能性。在2.5mM [Ca2+]ex存在的情况下结果发现CPPs可触发浓度依赖性IL-1释放，如果没有进一步的Ca2+添，CPPs对IL-1β释放的影响很小(Fig. 5a)。单核细胞[Ca2+]诱导CPP摄取后IL-1β释放的结果显示，在有[Ca2+]ex存在的低[Pi]介质中，CPP的形成在3小时后就开始了，并且比在有5.6 mM [Pi]存在的介质中生产[Ca2+]的速度更快(Fig.5b)。Fig. c结果表明[Ca2+]ex 诱导的IL-1β释放依赖于肌动蛋白聚合。CA-074-Me的药物组织蛋白酶B抑制降低了[Ca2+]诱导的IL-1β抗氧化反应，该结果进一步支持了被吞噬的CPPs的溶酶体消化有助于[Ca2+]ex诱导的炎症小体激活和单核细胞中IL-1β释放(Fig. 5d)。过滤掉大颗粒CPPs后，[Ca2+]ex诱导的IL-1β释放显著下降，说明CPPs的大小和浓度与炎症小体的激活有关(Fig. 5e)。当通过增加培养基中的胎球蛋白-A浓度来增加颗粒生成过程中胎球蛋白-A和[Ca2 +]的比例时，观察到浓度依赖性的IL-1β释放降低（图5f）。 添加PFA抑制了[Ca2 +]浓度依赖诱导的IL-1β释放（图5g）。总之，上述结果表明[Ca2 +]摄取后形成CPPs会诱导炎症小体激活IL-1β释放，且具有浓度依赖性。

Fig. 5 [Ca2+]ex mediated calciprotein particle uptake mediates inflammasome activation

4、[Ca2+]ex诱导的IL-1β释放在RA中是增加的
    为了进一步证实体内炎症与对[Ca2 +] ex和CPPs反应之间的联系，作者进行了体内实验，结果发现[Ca2+]ex增加的几次导致RA单核细胞的IL-1β释放高于健康供体(Fig. 6a)，并且无疾病缓解性抗风湿药（DMARD）的RA患者在用[Ca2 +] ex刺激后产生更高的IL-1β浓度。 除了IL-1β，与健康供体相比，在用[Ca2 +] ex刺激后，RA单核细胞还释放了更高浓度的IL-1α和IL-18（Fig. 6b，c）。DMARD的RA患者在用[Ca2+] ex刺激后产生更高的IL-1β浓度。 除了IL-1β，与健康供体相比，在用[Ca2+] ex刺激后，RA单核细胞还释放了更高浓度的IL-1α和IL-18（Fig.b，c）。与来自健康供体的单核巨噬细胞相比，当单核巨噬细胞在体外从RA单核细胞分化时，在[Ca2+]ex刺激后，它们也表现出更高的IL-1钾离子浓度(Fig. 6e)。较高比例的RA单核细胞内化钙素染色表明它们增加的倾向是响应[Ca2+]ex，但只对LPS刺激响应（Fig. 6f）。Fig. 6g证实RA中[Ca2+]ex诱导的IL-1β释放和CPPs摄取导致可能是因为CaSR信号的增加导致的。

Fig. 6 Increased [Ca2+]ex-induced, CPP-dependent inflammasome activation in RA.

    为了研究溶酶体渗漏是否有助于[Ca2+]ex诱导的NLRP3炎性小体活化，将溶酶体用stain啶橙染色，并在存在5.6mM Pi的情况下用2.5mM Ca2 +刺激，或用MSU晶体或溶酶体破坏剂刺激L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯（LLOMe）作为阳性对照。成像流式细胞仪显示，与阴性对照相比，用[Ca2+]ex刺激后，溶酶体膜的完整性没有改变（Fig. 7a）。 相比之下，MSU晶体和LLOMe诱导了溶酶体渗漏，由孵育4小时后明亮细节荧光强度显着降低所表明。RA单核细胞与健康供体之间的溶酶体渗漏比较没有显示差异（Fig. 7a）。
    通常认为炎症小体激活和随后的IL-1β释放与细胞焦亡或炎性细胞死亡有关，这促使我们研究细胞存活。流式细胞仪（Fig. 7b，c）和标准LDH释放测定（Fig. 7d）分析的碘化丙啶（PI）/ Hoechst染色均表明，在发生IL-1β释放的条件下，细胞死亡增加。来自RA患者的单核细胞在单独用LPS刺激后显示出增加的细胞存活率，但由[Ca2+]ex或ATP诱导的单细胞死亡率与健康供体无差异（Fig. 7d）。在上述健康的供体中，在升高的[Ca2 +]/Pi条件下细胞死亡率与相应的IL-1β释放密切相关（Fig. 7e）。细胞死亡部分取决于NLRP3（Fig. 7f）和CaSR（Fig. 7g）的存在。结果表明，抑制CaSR介导的CPP摄取或抑制溶酶体CPP分解可显著抑制细胞死亡(Fig.7h)。总之，CaSR介导的CPP摄取诱导的炎症小体激活和随后的IL-1β释放与细胞死亡有关。

Fig. 7 [Ca2+]ex-induced CPP uptake in monocytes does not induce lysosomal leakage.

5、[Ca2+]ex诱导的IL-1β释放作用于局部炎症
    接下来，研究了关节炎对[Ca2 +]和[Ca2 +] ex诱导的IL-1β分泌的影响。RA患者的滑液样本中[Ca2 +]浓度高于骨关节炎或非侵蚀性关节疾病患者的关节积液（Fig.8a）。此外，与骨关节炎样品相比，在RA患者的滑膜衬里层中发现CaSR表达上调（Fig.8c）。为了研究CaSR在体内关节炎中的作用，将变构CaSR调节剂R568用于DBA / 1J小鼠的胶原蛋白抗体诱发的关节炎（CAIA）模型中。图8d所示的结果表明，在该小鼠模型中，CaSR信号转导的正调节加重了关节炎。
    为了进一步研究[Ca2 +]在糜烂性关节炎中的作用，首先，从外周血，骨髓和腹膜腔中分离CD11b +单核细胞，以确认糜烂性关节炎与单核细胞IL-1β对[Ca2 +] ex升高的反应之间的联系。在所有研究的细胞群中，与对照小鼠相比，CIA小鼠的细胞显示出更强的[Ca2 +] ex诱导的IL-1β反应（Fig.8e）。切片显示钙红染色在骨侵蚀部位和软骨剥夺的关节表面呈阳性染色（Fig.8f）。因此，通过从股骨中清除骨髓并测量这些骨髓潮红中的[Ca2 +]来确定CIA中骨骼中Ca2 +的释放。与对照小鼠相比，关节炎DBA / 1J小鼠的髓内[Ca2 +]显着增加（Fig.8g），这表明Ca2 +从CIA的骨基质中释放的增加。 [Ca2 +] ex诱导的IL-1β释放与骨髓潮红中确定的[Ca2 +]量（Fig.8h）和CIA评分确定的关节炎严重程度（Fig.8i）相关。

Fig. 8 Bone erosion in arthritis leads to locally increased [Ca2+] and elevated IL-1β secretion.

    总之，本文发现单核细胞通过大胞饮作用吞噬CPPs，并且此过程严格取决于[Ca2 +] ex的增加触发的CaSR信号传导。CPP的巨胞饮作用增强，导致溶酶体活性增加，NLRP3炎性体激活和IL-1β释放。类风湿关节炎（RA）中的单核细胞响应CaSR信号转导显示CPP摄取增加和IL-1β释放。这些单核细胞和受累关节中局部[Ca2 +]诱导的CaSR表达增加，可能有助于这种增强的炎症反应。CaSR介导的NLRP3炎性小体活化不仅在RA中而且在其他炎性疾病中也可引起炎性关节炎和全身性炎症。抑制CaSR介导的CPP摄取可能是治疗RA的治疗方法。
参考文献：
Jäger Elisabeth., Murthy Supriya., Schmidt Caroline., Hahn Magdalena., Strobel Sarah., Peters Anna., Stäubert Claudia., Sungur Pelin., Venus Tom., Geisler Mandy., Radusheva Veselina., Raps Stefanie., Rothe Kathrin., Scholz Roger., Jung Sebastian., Wagner Sylke., Pierer Matthias., Seifert Olga., Chang Wenhan., Estrela-Lopis Irina., Raulien Nora., Krohn Knut., Sträter Norbert., Hoeppener Stephanie., Schöneberg Torsten., Rossol Manuela., Wagner Ulf.(2020). Calcium-sensing receptor-mediated NLRP3 inflammasome response to calciprotein particles drives inflammation in rheumatoid arthritis. Nat Commun, 11(1), 4243. doi:10.1038/s41467-020-17749-6