lncRNA与癌症发展联系大揭秘——UCA1与胃癌

  lncRNA在多种细胞过程中发挥着重要的作用，近年来，关于lncRNA的研究已逐渐成为一个热门项目。UCA1是一种已被发现的lncRNA，研究者们发现它多种癌细胞的迁移、侵袭和耐药密不可分。今年7月，Dr. Wang CJ等人在杂志《molecular cancer》上发表了一篇题为“The lncRNA UCA1 promotes proliferation, migration, immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs”的文章，探究了长链非编码RNA UCA1在胃癌发生发展过程中所扮演的角色，揭露了UCA1促进胃癌细胞增殖、迁移、免疫逃逸的机制，为治疗胃癌提供了新的思路

摘要：

背景：UCA1是一类长链非编码RNA，在胃癌（GC）等多种人类肿瘤中均被发现存在过表达现象。目前认为UCA1能够促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，但UCA1在整个免疫逃逸过程中的作用尚不清楚。

方法：我们收集了40对胃癌和非肿瘤组织样本。采用原位杂交和qRT-PCR法测定 UCA1在胃癌和对照组织中的表达水平。采用MTT法测定细胞活力。使用transwell法检测GC细胞的迁移能力。为了了解UCA1在免疫逃逸过程中的作用，野生型或UCA1 KO GC细胞与外周血单核细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞在体外共培养。用小鼠模型检测UCA1在体内的功能。

结果：UCA1促进GC细胞增殖和迁移，并抑制细胞凋亡。UCA1通过直接作用抑制miR-26a/b，miR-193a和miR-214的表达，进而上调PDL1的表达。当与外周血单核细胞（PBMCs）共培养时，UCA1-KO GC细胞可以诱导更高的IFNγ表达，当在体外与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养时存活率较低。UCA1-KO GC细胞形成较小的肿瘤，miR-26a、- 26b、- 193a和- 214水平较高，异种移植小鼠模型细胞增殖减少，凋亡增加。

结论：UCA1过表达保护PDL1表达不受miRNAs的抑制，促进GC细胞的免疫逃逸。UCA1可作为一种潜在的新型GC治疗靶点。UCA1(尿路上皮癌相关1)是一种最早在人类膀胱癌中被发现的lncRNA，在许多其他癌症中发现其表达上调，参与癌细胞的迁移、侵袭和耐药。

技术路线：

  研究者的实验思路大致如下：

结果：

一、GC患者体内UCA1升高，且与肠型GC患者预后不良有关

  研究者首先利用两个已发表的芯片GSE54129（111例胃癌患者和21例对照组）和GSE65801（32对胃癌和非癌组织）分析了UCA1在胃癌组织和非癌对照组织中的表达。然后收集了40对胃癌和非癌组织样本（21例肠型，13例弥漫型，7例混合型），用qRTPCR检测UCA1水平。为进一步证实UCA1在GC组织中的上调并确定其亚细胞位置，研究者使用原位杂交（ISH）检测UCA1在 GC和对照组织切片中的表达。最后，研究者分析Dr. Szász AM等人报道的数据（320例肠型GC, 241例弥漫型GC, 32例混合型GC），发现UCA1水平较高的肠型GC患者总体生存率较低，这说明UCA1在胃癌发生过程中具有潜在的致癌作用。

Fig. 1 在GC组织中发现UCA1调解异常，与预后不良有关。a 用T检验对两个芯片（GSE54129和GSE65801）的UCA1水平进行分析。P < 0.05为差异有统计学意义。 B采用qPCR法检测40对胃腺癌及相应的邻近非肿瘤性胃组织的UCA1水平。结果按照Lauren分类显示，采用单因素方差分析法分析。**p < 0.01。 c 具有代表性的原位杂交图像显示UCA1在GC和对照组织中的表达。用图像J量化UCA1信号的相对密度，用T检验确定其显著性。比例尺，100 μM。 d 采用Kaplan-Meier分析320例肠型GC、241例弥漫型GC和32例混合型GC的生存数据进行分析，p < 0.05为差异有统计学意义

二、UCA1是一类促进胃癌细胞增殖、迁移并抑制凋亡的致癌基因

  为探讨UCA1在GC细胞中的生物学功能，研究者构建了UCA1过表达载体，建立了UCA1过表达GC细胞系。同时构建UCA1敲除载体，该载体表达两个针对UCA1启动子区域的向导RNA，构建UCA1敲除细胞系。

  研究者利用MTT检测细胞的存活率，用流失细胞术检测细胞凋亡，由利用transwell检测细胞的迁移能力。

Fig. 2 UCA1是一种onco-lncRNA，能够促进GC细胞的增殖、迁移并抑制细胞凋亡。a成功建立UCA1过表达GC细胞。b 采用MTT法测定UCA1过表达细胞和对照组GC细胞的存活率。c 原理图为UCA1敲除载体设计。以UCA1启动子区为靶点的两个向导RNA通过一个质粒共表达。d 通过共转染UCA1-KD载体和Cas9表达载体，成功降低了两种GC细胞的UCA1水平。e MTT法测定UCA1-KD GC细胞的存活率。f 细胞凋亡检测。用FITC标记的Annexin V抗体孵育UCA1-KD或对照GC细胞，然后PI染色。流式细胞术测定细胞凋亡率。g和h细胞过夜，消耗血清，用丝裂霉素处理，然后进入Transwell的上腔室。用4%多聚甲醛固定迁移到下腔室的细胞，然后用结晶紫染色。使用倒置显微镜，在5个随机不同视野中对结晶紫染色细胞计数。结果用t检验进行分析，p < 0.05为差异有统计学意义。 *p < 0.05， **p < 0.01
三、UCA1与miR-26a/b相互作用，调控EZH2和CDK6的表达。
  近年来的许多报道指出，lncRNA可以对各种miRNA产生“海绵样”作用，从而抑制由miRNA介导的功能。研究者分析发现miR-26a和-b可以直接与UCA1结合并用双荧光素酶验证，除了检测UCA1在GC细胞中过表达时，内源性miR-26a和-b的表达水平变化外，研究者还检测了miR-26靶蛋白EZH2和CDK6的蛋白水平，随后，研究者用qRT-PCR测定体内miR-26a和-b水平。结果证明，UCA1通过海绵作用吸附miR-26a/b以调控EZH2和CDK6的表达。

Fig. 3 UCA1海绵作用吸附miR-26a/b，从而促进miR-26a/b靶基因的表达。a 预测miR-26a/b与UCA1之间的相互作用。 b 双荧光素酶检测。用UCA1 3'UTR报告载体和miR-26a/b模拟物或抑制剂转染HEK293T细胞。相互作用48小时后检测相对荧光素酶活性。c和d 过表达UCA1的GC细胞中miR-26a和-b水平受到抑制，miR-26a和-b靶基因表达上调。 e 采用qRTPCR法检测40对胃癌及相邻非肿瘤对照标本中miR-26a和-b的水平。通过相关分析，分析UCA1与miR-26a或-b的相关性。

四、UCA1直接与miR-214和miR-193a相互作用

  研究者发现发现miR-214和-193有被UCA1“海绵”吸附的潜力，此前有报道称此二者均具有抑制肿瘤的功能。研究者采用双荧光素酶法测定miRNA与UCA1的相互作用。

  PDL1可以与PD-1相互作用，抑制T细胞活化，诱导效应T细胞凋亡，最终削弱抗肿瘤免疫。研究者通过预测发现在PDL1 Mrna的3’UTR上存在miR-214和-193a靶点。随后研究者采用双荧光素酶法测定miRNA与PDL1的相互作用。

Fig. 4 UCA1与miR-193a和miR-214相互作用，然后调节PDL1的表达。a 预测UCA1与miR-193a或miR-214之间的相互作用。b 双荧光素酶检测。用UCA1全序列作为萤火虫荧光素酶3'UTR的报告载体，与HEK293T细胞共转染，并加入miRNA模拟物或抑制剂。转染48小时后检测荧光素酶活性。 c qRT-PCR检测miR-193a和- 214的相对表达。d 预测PDL1与miR-193a或miR-214之间的相互作用。e 双荧光素酶检测。将HEK293T细胞与PDL1 3'UTR报告载体和miR-193a或miR-214的模拟物或抑制剂共转染48h。检测荧光素酶活性，用t检验分析结果。 f miR-193a和miR-214抑制内源性PDL1表达

五、UCA1通过海绵miR- 214和miR-193a调控PDL1表达

  研究者通过western blot和流式细胞术分析了UCA1敲除后GC细胞中PDL1表达，以确定UCA1敲除是否可以通过海绵miRNA诱导GC细胞中PDL1下调进而减轻T细胞的抑制，同时使用拮抗剂进行挽救，以验证结论。由实验结果可以看出，细胞表面PDL1水平受UCA1-miR-193a/214轴调控。

  研究者通过检测释放到上清液中的IFNγ水平评估如果调控GC细胞株上PDL1的表达是否可以改变受PHA刺激的健康供体PBMC的活化。

  研究者还分析了在效应靶比为10:1至40:1的范围内，CIK细胞对AGS和SGC-7901细胞的细胞毒性。

Fig. 5 敲除UCA1可恢复受PHA刺激的T细胞活化，提高CIK治疗的细胞毒性。a UCA1-KD GC细胞中总PDL1水平降低。b 流式细胞术检测细胞表面PDL1。c PHA诱导的PBMCs与UCA1-KD或对照组GC细胞共培养。ELISA检测上清液中产生的IFNγ。d 降低GC细胞中PDL1的表达可以提高对体外CIK治疗的细胞毒性敏感性

六、UCA1调控PDL1表达，调节抗肿瘤免疫反应

  为了探讨UCA1敲除在体内肿瘤生长调控中的作用，研究者利用AGS细胞皮下异种移植小鼠模型检测UCA1的功能。将AGS-NC和AGSUCA1-KO细胞皮下注射到SCID小鼠体内。每7天测一次肿瘤体积，连续28天。

Fig. 6 UCA1表达的下调抑制了异种移植小鼠模型肿瘤的生长。a 我们利用AGS细胞株研究了UCA1下调对胃癌皮下移植小鼠模型调控的影响。将AGS-NC和AGS-UCA1-KD细胞皮下注射到SCID小鼠体内。每周测量肿瘤体积，连续4周。b 统计分析显示， PDL1表达下调显著抑制肿瘤生长。c 28天后，UCA1-KD组肿瘤重量较对照组轻(p < 0.001)。d qRT-PCR结果显示，UCA1-KD组miR-26a、miR-26b、miR-193a、miR-214水平升高。e 免疫组化结果显示，UCA1-KD组的PDL1蛋白水平和Ki-67表达均下降。f 免疫印迹结果显示，UCA1-KD肿瘤中裂解的PARP1和caspase-3表达水平升高

结论：

  UCA1可以通过抑制miR-26a和miR-26a等抗肿瘤miRNA的表达，促进胃癌细胞的增殖迁移，并抑制细胞凋亡；抑制miR-193a和miR-214等miRNA的表达，使PDL1表达上调，从而抑制宿主免疫系统的功能。UCA1-KO GC细胞在体内形成较小的肿瘤，miR-26a、- 26b、- 193a、- 214水平较高，细胞增殖减少，凋亡增加。

  这些研究证明，UCA1与GC的发生发展关系甚密，可以以其为新的切入点， 探究GC治疗的新靶点。