CRISPR文库筛选

CRISPR文库筛选

CRISPR文库筛选是一种基于CRISPR-Cas9基因编辑系统的大规模功能基因筛选技术，通过构建包含大量靶向不同基因sgRNA的混合文库，在细胞群体中并行敲除/激活/抑制成千上万个基因，通过压力（药物筛选、流式分选等）筛选并结合高通量测序，系统性筛选调控特定生物学表型的关键基因。

图1 CRISPR文库筛选实验流程示意图

CRISPR文库筛选步骤

1、选择合适的细胞模型：细胞要具有一定的传代能力，并能承受筛选条件（如化合物、低氧等），可稳定表达Cas9或dCas9（用于敲除/激活/干扰）。

2、文库构建与包装：构建全基因组或通路特异文库质粒，并包装为慢病毒，保证高质量、低偏差传递到细胞。

3、文库感染与建库：低MOI感染细胞，保证每个细胞仅携带一个sgRNA。

4、施加筛选压力选择：对感染文库的细胞施加特定条件（如化合物处理、传代、流式分选），设定处理组与对照组，进行富集筛选。

5、基因组DNA提取与NGS测序：提取细胞基因组DNA，扩增sgRNA条码区，进行高通量测序。

6、生物信息分析与候选基因筛选：使用MAGeCK、edgeR等分析工具识别富集/耗竭的sgRNA，筛选候选关键基因。

CRISPR文库筛选应用案例

1、CRISPR筛选发现去泛素化酶ATXN3作为PD-L1的正向调控因子参与肿瘤免疫逃逸

调控肿瘤细胞表面的PD-L1表达，对于深入理解肿瘤免疫逃逸机制以及改进现有抗肿瘤免疫疗法至关重要。在本研究中，作者构建了一个涵盖96个去泛素化酶家族成员的CRISPR筛选平台，通过分析PD-L1低表达和高表达细胞群体，鉴定出ATXN3是PD-L1转录的正调控因子（图2）。ATXN3缺失的肿瘤对低剂量抗PD-1治疗反应更好，其抑制可增强免疫检查点阻断治疗效果。本研究首次揭示了ATXN3作为去泛素化酶在PD-L1转录调控中的关键正向作用，并为临床上通过靶向ATXN3来增敏免疫检查点阻断疗法的疗效提供了坚实的理论依据。

图2 去泛素化酶CRISPR文库筛选实验流程图¹

预实验确定达到MOI为0.3所需的慢病毒浓度后，以MOI 0.3用混合DUB-KO慢病毒文库感染16黑色素瘤细胞（高表达PD-L1）。感染48小时后，加入2 μg/mL嘌呤霉素处理3–4天，同时设置未转导对照以确定筛选时长。此后细胞继续培养3–4天，通过细胞内Cas9染色进一步验证筛选后癌细胞的感染效率（图3B和C），然后进行流式分选。分选依据为PD-L1高表达（PD-L1 MFI前5%）和PD-L1低表达（PD-L1 MFI后5%），以分别鉴定PD-L1的负调控因子和正调控因子（图3D）。每个细胞群至少分选150,000个细胞，以保证每条向导RNA至少覆盖500个细胞。分选后的细胞离心沉淀并速冻。

图3 流式鉴定感染效率及分选PD-L1高、低表达细胞¹

从分选后的细胞中提取基因组DNA，通过一步PCR扩增携带向导序列的特异性区域，用于测序。使用MAGeCK软件的count和test功能，分析在PD-L1低表达或高表达群体中富集的向导。利用MAGeCK放射性受体分析富集分数（radioreceptor assay enrichment score）对基因进行排序。分析排名靠前的基因中各sgRNA读数的倍数变化。根据P值筛选向导以进行进一步验证。四个去泛素化酶ATXN3, USP30, USP32, OTULIN在PD-L1低表达细胞中富集，可能是PD-L1正调控因子（图4 E–H）。

图4 MAGeCK软件文库测序数据¹

2、核转位的GCLM通过“双重功能”促进结直肠癌的化疗耐药性

在肿瘤进展过程中，代谢酶会发挥多种功能，包括调节化疗耐药性。然而，这些功能背后的机制仍不清楚。作者利用靶向1773个代谢酶基因的CRISPR敲除文库在结直肠癌细胞中进行功能缺失筛选，发现GCLM（谷胱甘肽生物合成的限速酶）的缺失，会显著提高结直肠癌（CRC）细胞对铂类化疗的敏感性。机制研究表明，核内GCLM通过与NF-κB抑制因子（NKRF）竞争性相互作用，促进NF-κB活性并驱动化疗耐药性。本研究揭示了GCLM在增强NF-κB活性及驱动化疗耐药性方面所发挥的关键非代谢作用及其翻译后调控机制。

人代谢酶sgRNA文库文库共靶向1,773个代谢酶编码基因，每个基因设计4条sgRNA，随后将该文库包装成慢病毒。在奥沙利铂（oxaliplatin）处理条件下进行体外CRISPR-Cas9基因敲除筛选。首先，将4×10⁷个HCT116细胞接种培养，并以较低的感染复数（MOI=0.3）感染上述慢病毒sgRNA文库，同时加入10 μg/mLpolybrene（聚凝胺）。感染后的细胞使用嘌呤霉素（0.8μg/mL）筛选7天，以去除未感染的细胞。随后，将筛选后的细胞分别给予PBS或10μM奥沙利铂处理7天。处理结束后，收集剩余的存活细胞，提取其基因组DNA。随后进行NGS测序和数据分析（图5a）。

图5 HCT116细胞CRISPR文库筛选流程图²

通过比较 3个奥沙利铂处理组与对照组中的排名前100位基因，共鉴定出 52个关键代谢酶基因（图6b）。在这52个候选基因中，根据GEPIA数据库的分析结果，我们进一步筛选出在结肠和直肠腺癌患者中相较于正常人高表达的基因，并从中选取 10个基因进行细胞活力实验，以验证这些基因在奥沙利铂敏感性中的作用。其中GCLM敲除后，结肠癌细胞对奥沙利铂敏感性程度增加最大（图6c）。

图6 GCLM耗竭增强结直肠癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性²

3、Rbfox3促进MDSC样肿瘤细胞的转化并塑造免疫抑制性微环境

肿瘤微环境（TME）中的髓源性抑制细胞（MDSCs）通过发挥免疫抑制作用，促进肿瘤的恶性进展。已有大量研究表明， LPS在多种实体瘤中普遍存在。LPS可促进肿瘤的恶性进展，其具体机制尚未完全阐明。本研究发现，在低剂量、长期LPS刺激诱导的肿瘤组织中，存在一种MDSC样肿瘤细胞（MLTCs）。MLTCs可同时表达肿瘤细胞和MDSCs的标志物。与MDSCs类似，MLTCs能产生精氨酸、一氧化氮和活性氧，并抑制自然杀伤细胞（NK细胞）和T细胞的活性，从而促进免疫抑制微环境的形成。

研究人员利用靶向23,439个小鼠基因的全基因组CRISPRa文库，筛选了在LPS刺激下促进B16黑色素瘤细胞转化为MDSC样肿瘤细胞（MLTCs）的关键调控因子（图7A）。通过正向筛选获得的基因以火山图的形式展示（图7B）。将 log₂(Fold Change) > 10且 lg（Differential Gene Expression）> 10 的基因定义为在 MLTCs中高表达的基因。对Mageck筛选得到的排名前500位基因与1,094个高表达且具有显著差异表达的基因进行筛选，最终获得52个基因（图7C）。根据这52个基因所对应的 sgRNA 数量进行进一步筛选，其中9个基因其对应的sgRNA数量均大于3（图 7D）。对对应sgRNA数量最多的基因两个Rbfox3, Nbr1，进行单独敲除检测，鉴定出RNA结合蛋白Rbfox3为关键驱动因子。Rbfox3形成相分离的核内液滴，在转录水平抑制Ass1基因的表达，从而发挥免疫抑制功能。天然产物藏红花素可破坏Rbfox3的相分离，抑制MLTC的产生，并增强抗PD-1疗法的疗效。

图7 CRISPR文库筛选实验流程及结果³

4、在肿瘤中富集的小分子藤黄酰胺通过靶向WDR1依赖性细胞骨架重塑来抑制胶质瘤

胶质瘤是最常见的脑肿瘤，其治疗方案有限；而恶性胶质瘤和胶质母细胞瘤（GBM）患者的预后较差。血脑屏障（BBB）以及胶质瘤干细胞（GSCs）对药物输送构成的物理障碍，被认为是导致临床疗效不佳的关键因素。在本研究中，作者发现小分子藤黄酰胺（GA-amide）能够有效穿过血脑屏障（BBB），并在肿瘤区域内呈现显著富集。此外，GA-amide在多种体内胶质瘤模型（包括转基因模型和原发性患者来源异种移植（PDX）模型）中均表现出显著的抑制肿瘤生长的功效。作者进一步开展了全基因组CRISPR文库敲除筛选，以确定GA-amide的可成药靶点。文库包含76,441条sgRNA分子，每个基因4条sgRNA。将1.2 × 10⁸个细胞以MOI = 0.3的感染复数转导慢病毒sgRNA文库，以实现每条sgRNA约300倍的覆盖度。随后，在含1μg/mL嘌呤霉素的培养条件下维持培养72h，以完成感染细胞的筛选及基因编辑。成功转导慢病毒sgRNA文库的T2-4细胞随后分别接受高剂量（LD80）GA-amide、低剂量（LD20）GA-amide或DMSO处理，持续21天。处理结束后进行深度测序及相关分析，以确定各组中sgRNA的分布情况（图8）。

图8 CRISPR全基因组敲除文库筛选实验流式示意图⁴

文库筛选测序结果显示，在所有样本中约有99.9%的sgRNA序列得以保留，从而保证了CRISPR文库筛选过程中几乎完整的文库覆盖度（图9b）。与此同时，GA-amide处理组第21天的sgRNA分布与DMSO对照组细胞相比存在显著差异（图9c）。使用MAGeCKFlute分析第21天对照组和高剂量GA-amide处理组中的sgRNA，鉴定出1,534个正向富集基因，这些基因被认为是药物敏感性相关基因（图9d）；其中排名前10位的基因展示于图9e。九象限图进一步展示了排名前5位的正向筛选基因，其中包括WDR1（图9f）。作者进一步通过细胞热迁移实验（CETSA）、药物亲和反应靶点稳定性分析（DARTS）、分子对接等确认WDR1是GA-amide药物靶点基因。

图9 CRISPR文库测序结果⁴

5、基于高内涵 CRISPR 激活筛选鉴定合成致死的 RNA 机制及其增强癌细胞对靶向 T 细胞杀伤敏感性的作用

T细胞通过T细胞受体（TCR）识别癌症新生抗原，结合癌细胞后通过释放颗粒酶和穿孔素，诱导癌细胞凋亡。Akana等在人原代CD8⁺ T细胞过表达一种具有临床活性的TCR，该TCR可识别A375黑色素瘤细胞表达的NY-ESO-1抗原；然后构建了一个包含32,670条sgRNA的文库，靶向2,919个基因（每个基因10个sgRNA）以及560个非靶向对照gRNA（图10）。CRISPR文库转染稳定表达CRISPR–dCas9-VPR的A375细胞，并将黑色素瘤细胞与来自同一供体的NY-ESO-1 TCR细胞或野生型T细胞进行三轮共培养。最终筛选鉴定出多种功能的TCR特异性细胞毒性调节因子，包括SAFB、KHDRBS1、MYC、CD44、WNT3A、WNT1等（图11）。

图10 TCR特异性细胞毒性调节因子CRISPR激活文库筛选流程图⁵

图11 CRISPRa筛选结果火山图⁵

6、VDAC2 缺失通过诱导肿瘤破坏和炎症反应发挥抗癌治疗作用

为鉴定与肿瘤免疫逃逸相关的代谢基因，Yuan等向表达Cas9和卵清蛋白（OVA）的B16F10（B16-OVA）黑色素瘤细胞中转染了靶向3,017个代谢相关基因的单gRNA文库，并在T细胞介导的免疫压力条件下进行了CRISPR敲除筛选（图12a）。在体外和体内响应免疫压力的肿瘤细胞中，靶向Vdac2的sgRNA属于耗竭最显著的sgRNA之一（图12 b,c），提示其在肿瘤免疫逃逸中发挥作用。研究人员进一步将靶向19,674个基因的全基因组sg文库转染到B16-OVA-sg Vdac2细胞中，通过遗传相互作用筛选，确定BAK是介导VDAC2缺陷所引起效应的关键分子（图13）。

图12 肿瘤免疫逃逸相关代谢基因CRISPR筛选⁶

图13 BAK介导VDAC2缺陷驱动的IFNγ应答效应⁶

7、基于 CRISPR 筛选和小鼠体内 QTL 定位鉴定前胰岛素调控因子

β细胞和血液中前胰岛素（proinsulin）水平的改变是糖尿病及其他疾病的标志性特征，但对proinsulin调节因子的了解仍然有限。在此，Lai等通过全基因组CRISPR筛选，鉴定出84种能改变小鼠β细胞系内proinsulin/insulin比值的proinsulin调节因子。这些proinsulin调节因子与先前通过正交CRISPR筛选获得的胰岛素调节因子不同（图14）。对这些proinsulin调节因子的功能注释表明，高尔基体是proinsulin储存和调节的主要细胞器。向高尔基体的转运会增加细胞内proinsulin与insulin的比值，而远离高尔基体的转运（包括胞吐作用和高尔基体至内质网的逆向转运）则会降低细胞内proinsulin水平。

图14 proinsulin调节因子全基因组CRISPR筛选⁷

CRISPR文库种类

KO文库：全基因组文库、表观遗传基因、细胞凋亡与肿瘤、膜蛋白、药物靶点&激酶&磷酸酶、泛素化与去泛素化、RNA结合蛋白、转录因子、脂滴与代谢、代谢基因、信使RNA结合蛋白等亚文库。

激活文库：全基因组文库、膜蛋白文库

参考文献

1、Wang S, Iyer R, Han X, et al. CRISPR screening identifies the deubiquitylase ATXN3 as a PD-L1-positive regulator for tumor immune evasion. J Clin Invest. 2023;133(23):e167728. Published 2023 Dec 1. IF: 14.3 Q1

2、Lin JF, Liu ZX, Chen DL, et al. Nucleus-translocated GCLM promotes chemoresistance in colorectal cancer through a moonlighting function. Nat Commun. 2025;16(1):263. Published 2025 Jan 2. IF: 18.1 Q1

3、Li Z, Feng Z, Chen M, et al. Rbfox3 Promotes Transformation of MDSC-Like Tumor Cells to Shape Immunosuppressive Microenvironment. Adv Sci (Weinh). 2025;12(8):e2404585. IF: 14.1 Q1

4、Qu J, Qiu B, Zhang Y, et al. The tumor-enriched small molecule gambogic amide suppresses glioma by targeting WDR1-dependent cytoskeleton remodeling. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):424. Published 2023 Nov 8. IF: 81.2 Q1

5、Akana RV, Yoe J, Laveroni O, Sun C, Kim YM, Jerby L. High-content CRISPR activation screens identify synthetically lethal RNA-based mechanisms to sensitize cancer cells to targeted T cell cytotoxicity. Nat Genet. 2026;58(4):841-853. IF: 25.5 Q1

6、Yuan S, Sun R, Shi H, et al. VDAC2 loss elicits tumour destruction and inflammation for cancer therapy. Nature. 2025;640(8060):1062-1071. IF: 56.1 Q1

7、Lai S, Keller MP, Zhang J, et al. Proinsulin regulators identified with CRISPR screen and in vivo mouse QTL mapping. Nat Commun. 2026;17(1):5159. Published 2026 Apr 13. IF: 18.1 Q1