黄芪来源纳米颗粒如何“激活”癌细胞死亡？——HELNs诱导铁死亡、重塑免疫微环境并调控肠道菌群的新机制

       前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，随着疾病进展，部分患者会进一步发展为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），导致现有治疗方案逐渐失效。因此，寻找更加安全有效的新型治疗策略，仍是前列腺癌研究领域亟待解决的重要问题。近年来，植物来源外泌体样纳米颗粒（plant-derived exosome-like nanoparticles，PELNs）因其天然来源、生物相容性良好以及具有递送活性分子的能力，逐渐成为肿瘤治疗领域的新兴研究方向。黄芪（Astragalus membranaceus）作为传统中药材，长期被用于疾病治疗，并被发现具有免疫调节、抗炎以及抗肿瘤等多种药理作用。然而，黄芪发挥抗肿瘤作用的具体物质基础以及作用机制仍未完全明确。那么，黄芪是否能够通过其来源的纳米颗粒结构，实现对肿瘤细胞和肿瘤微环境的精准调控？本研究发现，黄芪来源外泌体样纳米颗粒（Huangqi-derived exosome-like nanoparticles，HELNs）能够直接作用于前列腺癌细胞，通过降低GPX4表达诱导铁死亡；同时，HELNs还能促进M2型巨噬细胞向M1型转化，并增加具有抗肿瘤作用的肠道菌群，从多个层面发挥抗前列腺癌作用。研究进一步揭示了一种基于传统中药来源纳米颗粒的前列腺癌治疗新策略。本文于2026年3月发表在《Journal of Nanobiotechnology》IF：15杂志上。

技术路线：

主要研究结果：

1.黄芪来源外泌体样纳米颗粒HELNs的分离与鉴定

       为了明确黄芪来源外泌体样纳米颗粒（Huangqi-derived exosome-like nanoparticles，HELNs）的基本结构特征，研究人员首先从新鲜黄芪（Astragalus membranaceus）根部提取HELNs，并通过差速离心方法进行纯化（图1A）。随后，研究人员利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）以及Zeta电位检测等方法，对HELNs的形态、粒径分布以及稳定性进行了系统鉴定。TEM结果显示，提取获得的HELNs呈现典型的球形纳米结构（图1B）。进一步通过NTA分析发现，HELNs粒径分布较为集中，其主要峰值约为112 nm（图1B），表明研究人员成功获得了具有稳定粒径特征的纳米颗粒。为了评估HELNs的稳定性，研究人员分别检测了其在不同储存条件以及不同pH环境下的结构变化。结果显示，HELNs在−80 ℃保存2个月后，其粒径仍保持稳定（图1C）；同时，在酸性环境（pH 4）和碱性环境（pH 10）孵育24小时后，HELNs仍表现出较好的稳定性（图1D-E）。对应的Zeta电位检测结果进一步证明，HELNs在不同条件下具有较稳定的表面电荷特征（图1F）。进一步的蛋白组成分析显示，SDS-PAGE以及蛋白质组学检测结果表明，HELNs中的蛋白成分主要分布于10–43 kDa范围内（图1G-H）。随后，研究人员通过脂质组学分析进一步解析HELNs的脂质组成，发现其主要脂质成分包括神经酰胺（Ceramide，Cer，占29.7%）、磷脂酸（Phosphatidic Acid，PA，占16.2%）、己糖神经酰胺（Hexosylceramide，Hex1 Cer，占11.58%）、三酰甘油（Triacylglycerol，TG，占9.4%）以及磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE，占7.5%）（图1I）。

图1 HELNs的提取流程及表征分析

2.HELNs可被前列腺癌细胞有效摄取，并发挥抗肿瘤作用

       为了探究HELNs是否能够进入前列腺癌细胞并发挥生物学作用，研究人员首先利用PKH26荧光染料对HELNs进行标记，并通过流式细胞术检测其在不同前列腺癌细胞中的摄取效率。结果显示，PKH26标记的HELNs能够被4种前列腺癌细胞系（22Rv1、LNCaP、PC-3和C4-2）有效摄取，进一步比较不同细胞系对HELNs的摄取能力发现，C4-2细胞表现出最高的摄取效率，在处理12 h后HELNs摄取比例达到98%；随后依次为PC-3和LNCaP细胞，而22Rv1细胞对HELNs的摄取速度相对较慢（图2A）。在确认HELNs能够进入前列腺癌细胞后，研究人员进一步评估其对肿瘤细胞生长的影响。通过CCK-8实验检测不同浓度HELNs处理后细胞活力变化，结果发现，HELNs能够以时间和剂量依赖性的方式降低4种前列腺癌细胞系的存活能力。其中，LNCaP和C4-2细胞对HELNs更加敏感，在8 μg/mL浓度处理后即可观察到明显的细胞活力下降；当HELNs浓度提高至32–64 μg/mL时，多数前列腺癌细胞的存活率下降至约50%左右（图2B）。由于已有研究发现，多种植物来源外泌体样纳米颗粒（PELNs）能够诱导肿瘤细胞凋亡，因此研究人员进一步检测HELNs是否具有类似作用。实验中，将4种前列腺癌细胞分为对照组、32 μg/mL HELNs处理组以及64 μg/mL HELNs处理组。结果显示，HELNs能够促进4种前列腺癌细胞发生浓度依赖性的凋亡，随着HELNs处理浓度升高，细胞凋亡水平进一步增加（图2C）。随后，为进一步评价HELNs对前列腺癌细胞恶性行为的影响，研究人员进行了克隆形成实验和Transwell迁移实验。结果发现，HELNs处理后，前列腺癌细胞形成的克隆数量明显减少，说明HELNs能够抑制肿瘤细胞长期增殖能力（图2D）。同时，Transwell实验显示，HELNs能够显著降低前列腺癌细胞迁移数量，提示其能够抑制肿瘤细胞迁移能力（图2E）。

图2 HELNs被前列腺癌细胞有效摄取并发挥体外抗肿瘤作用

3.单细胞测序揭示HELNs干预后前列腺癌免疫微环境的变化

        为了进一步明确HELNs治疗后前列腺癌肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的变化，研究人员采用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术，对HELNs干预后的肿瘤组织进行高分辨率分析。单细胞测序能够在单细胞水平解析不同细胞群体的转录特征，从而更加精准地揭示肿瘤细胞与免疫细胞在肿瘤微环境中的组成及变化。研究人员根据不同细胞群中特异性基因表达特征进行细胞类型注释，最终鉴定出中性粒细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞、B细胞以及T细胞等主要细胞群（图3A、B）。进一步分析发现，HELNs干预能够显著改变前列腺癌肿瘤微环境中的免疫细胞组成。与PBS对照组相比，HELNs处理后肿瘤组织中免疫细胞总体比例明显增加，其中中性粒细胞和M1型巨噬细胞比例出现显著升高（图3C），提示HELNs可能促进免疫细胞向肿瘤区域募集。为了进一步明确HELNs干预后发挥关键作用的细胞类型，研究人员进行了细胞间通讯分析。结果显示，与对照组相比，HELNs处理后不同细胞之间的通讯数量和通讯强度发生明显变化。其中，虽然中性粒细胞比例增加，但其与其他细胞之间的通讯强度反而降低；相比之下，M1型巨噬细胞参与的细胞通讯明显增强，提示HELNs不仅增加了M1型巨噬细胞数量，同时还增强了其在肿瘤微环境中的功能活性（图3D）。随后，研究人员进一步关注巨噬细胞亚群的变化。结果发现，HELNs治疗能够显著增加肿瘤组织中巨噬细胞总体数量（图3E），其中增加的巨噬细胞主要来源于具有抗肿瘤功能的M1型巨噬细胞，其比例在HELNs处理后明显升高（图3F）。M1型巨噬细胞能够通过抗原呈递以及吞噬肿瘤细胞等方式发挥抗肿瘤作用，因此研究人员进一步分析了HELNs干预后M1型巨噬细胞抗肿瘤相关功能的变化。研究人员首先检测了M1型巨噬细胞中与抗肿瘤免疫相关关键基因的表达水平。结果显示，HELNs处理后，M1型巨噬细胞经典抗肿瘤因子iNOS、IL-12和TNF-α对应基因（Nos2、Il12和Tnf）的表达均显著升高（图3G）。

       进一步KEGG通路富集分析发现，HELNs处理后的M1型巨噬细胞主要富集于IL-17信号通路、TNF信号通路以及脂质代谢相关通路（图3H），提示HELNs可能通过调控炎症免疫信号以及代谢过程增强M1型巨噬细胞功能。基于KEGG分析结果，研究人员进一步对HELNs干预后巨噬细胞代谢状态进行了分析。结果发现，HELNs能够影响M1型巨噬细胞脂质代谢过程，尤其表现为脂肪酸降解能力增强（图3I）。

图3 HELNs通过重塑肿瘤免疫生态增强抗肿瘤免疫反应

4.HELNs逆转M2型巨噬细胞极化并促进M1型抗肿瘤表型形成

       基于单细胞测序结果，研究人员发现HELNs干预后肿瘤微环境中的M1型巨噬细胞比例增加，并表现出更强的抗肿瘤特征。为了进一步验证HELNs对巨噬细胞极化的调控作用，研究人员在体外分离小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），并分别诱导形成M0型和M2型巨噬细胞模型。研究发现，低浓度HELNs即可引起巨噬细胞形态变化，因此研究人员选择5 μg/mL和10 μg/mL作为后续实验处理浓度。在M0型巨噬细胞中，HELNs处理显著提高了M1型巨噬细胞相关基因Nos2、Cd80和Tnfa的表达，同时降低M2型标志基因Cd206的表达（图4A-B），提示HELNs能够促进巨噬细胞向M1样抗肿瘤表型转变。进一步在M2型巨噬细胞模型中发现，HELNs不仅增强了M1相关基因表达，同时显著降低M2相关基因水平（图4C-D），表明HELNs能够逆转M2样免疫抑制状态，推动巨噬细胞向M1型方向重新极化。Western blot结果进一步验证了这一现象，在M0型巨噬细胞中HELNs提高了iNOS和ARG1表达，而在M2型巨噬细胞中则降低ARG1并增强iNOS表达（图4E）。随后，研究人员在前列腺癌荷瘤小鼠模型中进一步验证HELNs对肿瘤免疫微环境的影响。小鼠接受3次HELNs治疗，共持续9天（图4F）。结果显示，HELNs处理能够明显降低肿瘤负荷，同时不影响小鼠体重变化（图4G-K）。流式细胞分析显示，HELNs治疗后，肿瘤组织中M1型巨噬细胞比例显著升高，而M2型巨噬细胞比例明显下降（图4L-N）；免疫荧光染色结果进一步验证了这一变化（图4O）。

图4 HELNs逆转M2样巨噬细胞极化并促进M1样极化

5.HELNs增加小鼠肠道中具有抗肿瘤作用的益生菌丰度

       前文研究发现，HELNs能够重塑前列腺癌免疫微环境，促进M1型巨噬细胞形成。由于植物来源外泌体样纳米颗粒（PELNs）已被报道能够调节肠道菌群并发挥抗肿瘤作用，因此研究人员进一步探索HELNs是否能够通过影响肠道微生态参与其抗肿瘤过程。为了进一步明确HELNs对肠道菌群的影响，研究人员对HELNs治疗后小鼠粪便样本进行了16S rRNA测序分析，共纳入8个样本进行最终分析。在菌群组成分析中发现，小鼠肠道菌群主要由拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）以及变形菌门（Proteobacteria）组成（图5A）。随后，通过α多样性分析评价HELNs对肠道菌群丰富度和均匀度的影响。结果显示，Ace、Shannon、Chao1、Goods_coverage以及Simpson指数在HELNs治疗组和对照组之间均无显著差异（图5B），说明HELNs并未改变肠道菌群整体丰富度。然而，β多样性分析显示，两组小鼠肠道菌群组成发生了明显改变。基于Bray-Curtis距离和Jaccard指数的分析结果表明，HELNs治疗能够显著影响菌群整体结构（图5C、D）。为了进一步明确HELNs干预后发生变化的关键菌群，研究人员利用线性判别分析效应量（LEfSe）分析比较两组之间的差异菌群组成（图5E）。结果发现，HELNs处理后，多种菌群丰度明显增加，包括Verrucomicrobia门、Verrucomicrobiae纲、Marinifilaceae科、Verrucomicrobiales目、Akkermansiaceae科、Akkermansia属以及Odoribacter属等。其中，Akkermansia属受到研究人员重点关注。该属目前仅包含3个物种，其中研究最为广泛的是Akkermansia muciniphila（嗜黏蛋白阿克曼菌）（图5F）。为了进一步验证HELNs诱导的肠道菌群变化是否直接参与其抗肿瘤作用，研究人员进一步开展了粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）实验（图5G）。实验中，不同组小鼠分别接受来自健康小鼠、荷瘤小鼠以及HELNs治疗荷瘤小鼠的粪菌移植。结果显示，接受荷瘤小鼠粪菌移植的小鼠表现出更明显的肿瘤生长，而接受HELNs治疗小鼠粪菌移植的小鼠则出现明显降低的肿瘤负荷（图5H-K）。在整个实验过程中，各组小鼠体重均未出现明显差异（图5L），说明HELNs诱导的肠道菌群变化能够在不影响整体健康状态的情况下发挥抗肿瘤作用。

图5 HELNs通过重塑肠道微生态增强抗肿瘤作用

6.HELNs诱导前列腺癌细胞发生铁死亡

        研究人员进一步探索HELNs是否能够直接作用于前列腺癌细胞，并揭示其发挥细胞毒作用的具体机制。首先，研究人员进一步对差异表达基因（DEGs）进行通路富集分析发现，HELNs处理显著激活了与铁死亡（ferroptosis）相关的信号通路（图6A、B），提示HELNs可能通过诱导铁死亡抑制前列腺癌细胞生长。为了进一步验证这一现象，研究人员利用透射电子显微镜（TEM）观察HELNs处理后22Rv1和LNCaP细胞的超微结构变化。结果发现，HELNs干预后的肿瘤细胞出现典型铁死亡形态学特征，包括线粒体电子密度增加、线粒体缩小以及线粒体嵴结构破坏（图6C），进一步提示HELNs能够诱导前列腺癌细胞发生铁死亡。随后，研究人员通过流式细胞术检测铁死亡相关指标，对HELNs诱导铁死亡作用进行进一步验证。由于脂质过氧化以及细胞内铁离子积累是铁死亡过程中的两个重要特征，因此研究人员分别检测了细胞内活性氧（ROS）、脂质过氧化水平以及Fe²⁺含量。实验中，将细胞分为PBS对照组、32 μg/mL HELNs处理组以及64 μg/mL HELNs处理组。结果显示，HELNs能够以浓度依赖性的方式增加22Rv1细胞内ROS水平（图6D、E），促进脂质过氧化积累（图6F、G），并提高细胞内Fe²⁺水平（图6H、I）。GPX4是目前已知能够将磷脂氢过氧化物还原为磷脂、从而抑制过度铁死亡发生的重要抗铁死亡酶。Western blot结果显示，HELNs处理能够以浓度依赖性的方式降低GPX4蛋白表达水平（图6J）。为了验证HELNs在体内对人源前列腺癌细胞的杀伤作用，研究人员进一步建立了22Rv1细胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型（图6K）。结果显示，HELNs治疗能够显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积以及肿瘤重量（图6L-O），同时治疗期间小鼠体重未发生明显变化（图6P），表明HELNs具有良好的体内抗肿瘤效果。进一步通过免疫组织化学染色检测发现，HELNs处理后的肿瘤组织中GPX4表达明显降低（图6Q），进一步验证HELNs能够在体内诱导铁死亡。

图6 HELNs靶向GPX4激活铁死亡通路，抑制前列腺癌进展

7.HELNs负载siGPX4增强铁死亡效应并提高前列腺癌治疗效果

       研究人员进一步尝试利用HELNs作为药物递送平台，通过负载siRNA增强其抗肿瘤作用。基于HELNs能够抑制GPX4表达这一发现，研究人员选择靶向GPX4的siRNA作为递送药物，以期通过联合降低GPX4水平进一步促进铁死亡。首先，研究人员设计了3条不同序列的siGPX4（si1、si2、si3），并在22Rv1和LNCaP细胞中进行筛选。结果显示，si2序列能够最有效地降低GPX4 mRNA水平（图7A）以及GPX4蛋白表达（图7B），因此后续实验均采用si2序列作为siGPX4。随后，研究人员利用可逆电穿孔技术（reversible electroporation）将siGPX4装载进入HELNs内部，构建siGPX4负载型HELNs（siGPX4@HELNs）。进一步通过荧光显微镜观察siGPX4进入细胞的情况发现，游离siGPX4能够少量进入细胞，但由于其容易受到外界环境降解，功能发挥有限。相比之下，HELNs与siGPX4结合后能够增强细胞内荧光信号，而siGPX4@HELNs组表现出最强的荧光强度（图7C），证明HELNs能够有效包载并递送siGPX4进入肿瘤细胞。

       为了验证siGPX4@HELNs的治疗效果，研究人员进一步检测不同处理方式对GPX4表达的影响。Western blot结果显示，与HELNs单独处理组以及siGPX4与HELNs混合处理组相比，siGPX4@HELNs能够更加明显地降低前列腺癌细胞中GPX4蛋白表达水平（图7D）。虽然HELNs组和HELNs+siGPX4混合组同样能够降低GPX4表达，但游离siGPX4单独处理几乎无法有效影响GPX4蛋白水平，提示HELNs递送能够提高siGPX4的稳定性和作用效率。随后，研究人员进一步检测siGPX4@HELNs诱导铁死亡的能力。结果发现，与其他处理组相比，siGPX4@HELNs能够在22Rv1和LNCaP细胞中诱导更加明显的Fe²⁺积累（图7E、F）以及脂质过氧化水平升高（图7G、H），表明其能够进一步增强铁死亡过程。CCK-8实验结果进一步显示，siGPX4@HELNs处理组细胞活力最低（图7I），说明通过HELNs递送siGPX4能够显著增强HELNs本身的抗肿瘤作用。为了进一步评价siGPX4@HELNs在体内的治疗效果，研究人员建立了22Rv1细胞裸鼠皮下移植瘤模型，并将小鼠分为5组进行不同方式干预（图7J）。

        实验结果显示，siGPX4@HELNs治疗组小鼠肿瘤体积明显小于其他4组（图7K-M），同时肿瘤重量检测结果也呈现相同趋势（图7N），表明siGPX4@HELNs具有更强的体内抗肿瘤能力。在治疗过程中，各组小鼠体重均未出现明显变化（图7O），提示siGPX4@HELNs未对小鼠整体状态造成明显影响。

图7 siGPX4@HELNs在体内外增强前列腺癌治疗效果并具有良好安全性

结论

        综上所述，本研究揭示了黄芪来源外泌体样纳米颗粒（HELNs）治疗前列腺癌的新型抗肿瘤机制。研究发现，HELNs不仅能够直接作用于前列腺癌细胞，通过下调GPX4表达诱导铁死亡，从而抑制肿瘤细胞增殖；同时还能重塑肿瘤免疫微环境，促进M2型巨噬细胞向具有抗肿瘤功能的M1型巨噬细胞转化，并通过调节肠道菌群增加具有抗肿瘤作用的益生菌丰度，形成多层次的抗肿瘤效应。此外，本研究进一步构建了HELNs负载siGPX4的递送系统，通过增强GPX4抑制作用进一步促进铁死亡，提高了HELNs的治疗效果。整体而言，本研究揭示了“天然纳米颗粒介导的肿瘤细胞铁死亡—免疫微环境重塑—肠道菌群调控”的多维抗肿瘤模式，为前列腺癌精准治疗提供了新的策略，并为传统中药来源纳米颗粒在肿瘤治疗中的应用提供了理论依据。

参考文献：

An Y, Xu JZ, Ye GC, Sun JX, Xiang JC, Gong C, Zhang SH, Miao LT, Ma SY, Ding MX, Wang SG, Xia QD. Therapeutic translation of traditional Chinese medicine Huangqi derived exosome like nanoparticles: targeting prostate cancer through ferroptosis activation, immune reprogramming, and microbiome modulation. J Nanobiotechnology. 2026 Mar 11;24(1):447. Doi: 10.1186/s12951-026-04160-4. PMID: 41814394; PMCID: PMC13200340.