LINC01963通过METTL3/IGF2BP2轴介导的c-Myc的m6A修饰促进胰腺导管腺癌增殖

   C-Myc过表达是胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adencarcinoma，PDAC）的重要分子标志，但直接靶向C-Myc极具挑战性。确定参与c-Myc过表达的关键上游因子为c-Myc提供了有希望的间接靶点。在此，利用RNA测序数据集鉴定出了在PDAC中高表达且与c-Myc表达显著相关的lncRNA。其中，研究发现LINC01963能够与c-Myc相互作用。此外，LINC01963的高表达与PDAC的不良预后相关，并且功能研究证实，敲低LINC01963可抑制PDAC细胞的增殖及异种移植瘤的生长。机制研究确定LINC01963是c-Myc稳定性的关键调控因子，进而通过c-Myc/p21相关信号通路影响细胞周期。进一步的研究揭示，LINC01963通过保护METTL3免受KDM1B介导的K48连接泛素化和蛋白酶体降解，增强了c-Myc mRNA的m⁶A修饰。有趣的是，LINC01963还通过促进其与IGF2BP2及m⁶A修饰的c-Myc形成三元复合物，从而稳定了c-Myc mRNA。我们的研究表明，LINC01963通过METTL3/IGF2BP2轴对称调控c-Myc促进PDAC的肿瘤发生，提示间接靶向c-Myc的新策略。本文于2026年2月发表于Journal of Experimental &Clinical Cancer Research（IF=12.8）上。

技术路线：

结果：

1）LINC01963在PDAC中过表达并与c-Myc表达相关

   使用TCGA-PAAD数据集（n = 179），我们鉴定出135个在PDAC中高表达且与c-Myc mRNA正相关的lncRNA（图1A）。在GEO队列GSE183795（244对PDAC肿瘤-正常对）中，4173个转录本在PDAC组织中上调（图1A）。将这些集合相交，发现6个c-Myc相关的lncRNA在PDAC中稳定过表达（图1B）。其中，GSE42952中预后较差的PDAC患者中LINC01963的表达明显高于预后较好的PDAC患者（图1C）。值得注意的是，在CPTAC-PDAC队列中，LINC01963的高表达与较差的总生存期（OS）显著相关（图1D）。在QCMG-PAAD中，晚期疾病（II-IV期）的LINC01963表达高于早期疾病（I期）（图1E）。与此一致，对多个数据集的分析表明，与正常胰腺或邻近非肿瘤组织相比，胰腺组织样本中LINC01963的表达显著上调（图1F）。PDAC细胞系（PANC-1和MIA PaCa-2）中的LINC01963水平也高于人类正常胰腺导管细胞（HPNE）（图1G）。亚细胞分离分析（图1H）和RNA-FISH分析（图1I）表明，LINC01963在细胞核和细胞质中表现出双重定位，以细胞核分布为主。利用CPC2.0和CPAT数据库进一步评估了LINC01963的编码潜力，两者一致支持LINC01963具有可忽略的编码潜力（图1J-K）。总的来说， LINC01963是一种c-Myc相关的lncRNA，在PDAC中过表达，与晚期和较差的生存期有关。

2）LINC01963促进PDAC细胞体外增殖

   在测试的两个独立siRNA（001-002）中，siLINC01963−001表现出最有效的下调。因此，选择siLINC01963−001进行后续实验。在PANC-1和MIA PaCa-2细胞系中观察到一致的结果，其中CCK-8、集落形成和EdU实验共同表明，LINC01963敲低显著抑制PDAC细胞增殖，而其过表达则产生相反的效果（图2A-F）。

3）LINC01963在MIA PaCa-2和PANC-1原位模型中均能促进PDAC的体内生长

   接下来，我们评估了LINC01963在原位胰腺异种移植模型中的体内相关性（图3A）。在MIA PaCa-2异种移植物中，LINC01963敲低显著抑制肿瘤生长，如生物发光信号减少（图3B-C）和终点肿瘤体积明显缩小（图3D）所示，而不影响体重（图3E）。H&E染色证实肿瘤植入成功（图3F）， Ki-67染色显示shLINC01963肿瘤的增殖活性降低（图3G）。为了证实这些发现，我们建立了一个独立的PANC-1原位异种移植物。与MIA PaCa-2异种移植物的结果一致，纵向生物发光成像（图3H-I）、肿瘤体积和肿瘤重量（图3J-L）显示，在PANC-1肿瘤中，LINC01963沉默导致肿瘤负担明显减轻，体重没有变化（图3M）。综上所述，这些结果表明，LINC01963作为一种致癌lncRNA，在体内驱动PDAC的生长。

4）LINC01963通过介导c-Myc/p21相关信号通路发挥致癌作用

   在PDAC细胞中进一步研究了LINC01963和c-Myc之间的调控关系。qRT-PCR结果显示，在PANC-1和MIA PaCa-2细胞中，LINC01963敲低后，c-Myc mRNA显著减少（图4A）。然而，c-Myc的敲低对LINC01963的表达没有显著影响（图4B）。Western blotting还显示，LINC01963敲低降低，而LINC01963过表达使c-Myc蛋白水平升高（图4C）。综上所述，所有这些结果都表明LINC01963是c-Myc的上游调节因子，在mRNA和蛋白水平上增强其表达。c-Myc过表达有效地挽救了LINC01963敲低受损的细胞增殖，而c-Myc沉默则阻断了LINC01963诱导的增殖（图4D-E）。此外，c-Myc的过表达减轻了LINC01963敲低引起的G1阻滞。相反，c-Myc敲低显著抑制LINC01963过表达诱导的细胞周期进程（图4F）。为了确定参与LINC01963介导的细胞周期的关键c-Myc调控基因，我们筛选了潜在的候选基因，并观察到LINC01963的上调显著抑制CDKN1A mRNA水平（图4G）。Western blotting证实，在LINC01963上调后，细胞周期抑制剂p21（由CDKN1A编码）的蛋白水平也降低（图4H）。值得注意的是，敲低LINC01963诱导的p21表达增强在c-Myc过表达时被逆转，而敲低c-Myc则消除了LINC01963过表达对p21的抑制作用（图4I）。因此，这些结果表明，LINC01963通过介导c-Myc/p21相关信号轴促进PDAC细胞增殖。

5）LINC01963通过保护METTL3免受KDM1B介导的k48连锁泛素化而稳定c-Myc mRNA

   为了阐明LINC01963介导的c-Myc表达调控的分子机制，我们首先研究了其对c-Myc mRNA稳定性的影响。RNA稳定性分析显示，LINC01963敲低显著降低了c-Myc mRNA的半衰期（图5A）。鉴于m6A修饰在调节c-Myc mRNA稳定性中的作用已被充分证实，我们进一步探讨了LINC01963是否通过m6A依赖机制来稳定c-Myc mRNA。MeRIP-qPCR显示，沉默LINC01963显著降低了c-Myc mRNA的m6A修饰（图5B）。与这一发现一致，MeRIP-seq分析显示，在LINC01963基因敲低后，c-Myc mRNA的m6A峰值丰度显著降低（图5C）。为了进一步确定LINC01963介导的m6A修饰c-Myc mRNA的关键m6A调控因子，我们进行了RNA下拉实验，然后进行了western blotting、RIP-qPCR和RNA- FISH-IF实验。这些实验表明，m6A写入者METTL3特异性地结合到LINC01963上，并在PDAC细胞中与其共定位（图5D-F）。过表达LINC01963显著增加了METTL3蛋白水平，而敲低则降低了METTL3蛋白水平（图5G），这表明存在转录后调控。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理，逆转了LINC01963敲低和过表达对METTL3蛋白水平的影响（图5H）。与此一致的是，CHX追踪实验显示，沉默LINC01963显著缩短了METTL3蛋白的半衰期，而过表达则延长了其半衰期（图5I）。鉴于LINC01963对METTL3的调控依赖于蛋白酶体，我们将焦点放在了K48连接的泛素化上，这是一种经典的蛋白酶体靶向泛素链类型。沉默LINC01963提高了METTL3的K48连接泛素化水平，而MG132介导的蛋白酶体阻断则在两组中均稳定了这些泛素化的METTL3，并减弱了组间明显的差异（图5J）。为了阐明LINC01963调控METTL3泛素化的机制，我们筛选了靶向METTL3的潜在E3泛素连接酶，包括UbiBrowser 2.0预测的排名靠前的候选者以及先前报道过的METTL3的E3连接酶STUB1。在PDAC细胞系中的初步筛选显示，敲低STUB1或KDM1B均能显著提高METTL3蛋白水平（图5K）。然而，Co-IP实验表明，只有METTL3-KDM1B之间的相互作用会受到LINC01963的特异性调控。缺失LINC01963增强了METTL3与KDM1B的相互作用，而过表达LINC01963则削弱了这种结合（图5L）。这些结果表明，KDM1B是一个关键的E3泛素连接酶，介导了与LINC01963相关的METTL3的K48连接泛素化及蛋白酶体降解。

6）LINC01963特异性地与IGF2BP2的KH1-2结构域相互作用

   为了研究m6A读取器是否参与了LINC01963调控的c-Myc稳定性，我们进行了RNA下拉分析，然后进行了质谱分析。IGF2BP2，一个关键的m6A读取器，被确定为LINC01963的稳定结合伙伴（图6A）。这种相互作用通过RNA下拉结合western blotting（图6B）、RIP-qPCR（图6C）和RNA-FISH-IF检测（图6D）进一步验证。此外，catRAPID预测表明LINC01963和IGF2BP2之间的结合概率很高（图6E）。为了描绘特异性结合区域，我们首先分析了IGF2BP2的结构域，包括两个RNA识别基序（RRM1-2）和四个k同源结构域（KH1-4）。基于catRAPID预测，我们构建了flag标记的质粒，编码全长IGF2BP2和针对单个结构域的各种截断（图6F-G）。RIP-qPCR显示KH1-2区域是LINC01963结合所必需的（图6H-I）。同样，我们基于starBase和catRAPID的综合预测设计了截断的LINC01963片段（图6J）。体外RNA拉下实验鉴定出LINC01963的900-1101nt， 1346-1566nt和2035-2258nt区域是关键的IGF2BP2结合区域，提示有多个结合接口（图6K）。

7）LINC01963通过与IGF2BP2协同稳定c-Myc mRNA

   鉴于IGF2BP2能够稳定m6A修饰的mRNA并且能直接结合LINC01963，我们假设IGF2BP2是LINC01963诱导c-Myc mRNA稳定所必需的。mRNA稳定性实验显示，沉默IGF2BP2显著阻断了LINC01963介导的对c-Myc mRNA的稳定作用（图7A），证明了IGF2BP2在维持c-Myc稳定性中不可或缺的作用。有趣的是，缺失LINC01963显著减弱了IGF2BP2与m6A修饰的c-Myc的结合，且这一现象无法通过过表达METTL3来挽救（图7B）。这些发现突显了LINC01963通过促进IGF2BP2介导的对m6A修饰的c-Myc的识别来稳定c-Myc mRNA的关键作用。为了进一步探讨LINC01963与IGF2BP2之间的调控关系，我们分析了TCGA-PAAD和GETx数据集，并结合了qRT-PCR和Western blotting实验。综合分析表明，LINC01963在mRNA或蛋白水平上均未调控IGF2BP2的表达（图7C-E）。综上所述，这些发现表明LINC01963充当支架角色，与IGF2BP2及m6A修饰的c-Myc形成三元复合物，从而在PDAC细胞中稳定c-Myc mRNA。

结论：

   我们的研究已经确定了LINC01963是PDAC中一个新的致癌lncRNA，通过METTL3/IGF2BP2轴介导的m6A修饰来稳定c-Myc mRNA。LINC01963通过阻止METTL3参与KDM1B介导的k48连接的泛素化和蛋白酶体降解，增强了c-Myc m6A修饰，随后促进了依赖IGF2BP2的m6A修饰的c-Myc mRNA的稳定。沉默LINC01963通过破坏c-Myc/p21介导的细胞周期调节，抑制PDAC细胞体外增殖和体内肿瘤生长。这些发现不仅阐明了PDAC中新的LINC01963/METTL3/IGF2BP2/c-Myc调控轴，而且为间接靶向c-Myc提供了潜在的治疗策略。

参考文献：

Liu Q, Li R, Liu B, Liu H, Shi X, Yin X, Ju X, Zhang S, Wang J, Zhang Y, Liu X, Li D, Chen L, Niu Y, Wu H, Liang Z. LINC01963 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma proliferation via METTL3/IGF2BP2 axis-mediated m⁶A modification of c-Myc. J Exp Clin Cancer Res. 2026 Feb 4;45(1):63. doi: 10.1186/s13046-026-03650-5.