OTUD4去泛素化稳定EGFR并激活PI3K/AKT通路促进三阴性乳腺癌的侵袭

   去泛素化酶 OTUD4 在多种癌症中发挥癌基因的作用，但其在三阴性乳腺癌（TNBC）中的作用尚不清楚。通过生物信息学分析和实验验证，我们证明 OTUD4 在 TNBC 中过表达，并与不良预后相关。OTUD4 表达下调可降低 TNBC 的侵袭性，突显其致癌作用。从机制上讲，OTUD4 通过稳定 EGFR 表达和激活 PI3K/AKT 通路促进 TNBC 进展。这种稳定作用通过两种机制实现：OTUD4（568–1114aa）与 EGFR（958-1210aa）之间的直接相互作用以及 OTUD4 介导的 K48 连接多聚泛素链的切割。此外，OTUD4被NRP1募集去泛素化并进一步稳定EGFR。这些发现加深了我们对 TNBC 中 EGFR 信号传导的理解，并可能为新的治疗策略提供信息。本文于2026年2月发表于Cell Death and Disease（IF=9.6）上。

技术路线：

结果：

1）TNBC中OTUD4的高表达与不良预后相关

   为了评估OTUD4在乳腺癌中的表达，我们分析了来自TCGA-BRCA和UALCAN数据库的数据。与正常乳腺组织相比，三阴性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌、管腔A和管腔B亚型中OTUD4 mRNA和蛋白水平升高（图1A，B）。TNBC肿瘤组织与邻近非肿瘤组织的对比分析显示，OTUD4在TNBC中的表达明显升高（图1C）。同样，与正常乳腺上皮细胞系MCF10A和非TNBC细胞系MCF7、T47D、SKBR3、BT474相比，TNBC细胞系（MDA-MB-231、BT-549、HCC1937和HS578T）表现出更高的OTUD4蛋白水平（图1D）。TCGA数据库分析进一步表明，OTUD4表达升高与TNBC预后不良相关（图1E）。10个配对临床样本的免疫组织化学分析证实，与邻近组织相比，TNBC中OTUD4的表达更高（图1F）。基于上述结果，OTUD4可能与TNBC的预后有关。

2）OTUD4在体外促进TNBC细胞的侵袭性

   为了研究OTUD4在TNBC中的作用，我们在两种TNBC模型中产生了稳定的OTUD4敲低细胞系（图2A）。EDU、CCK-8和集落形成实验表明，OTUD4敲除显著降低TNBC细胞增殖（图2B-D）。在伤口愈合试验中，OTUD4敲低会损害伤口闭合，并在Transwell试验中减少TNBC细胞迁移（图2E，F）。为了进一步验证其致癌功能，我们在相同的TNBC模型中建立了过表达OTUD4的细胞系（图2G）。OTUD4过表达增强TNBC细胞增殖、集落形成（图2H-J）和迁移（图2H-J）。这些结果表明OTUD4增强了TNBC的侵袭性。

3）OTUD4在体外通过EGFR/PI3K/AKT通路促进TNBC的进展

   为了阐明OTUD4介导TNBC侵袭的分子机制，我们进行了富集分析，发现OTUD4上调与TNBC中EGFR和PI3K/AKT通路之间存在强烈关联（图3A）。相关分析进一步证实OTUD4与EGFR表达呈显著正相关（图3B）。定量蛋白质组学分析显示，与对照组相比，MDA-MB-231细胞中OTUD4的敲低降低了OTUD4和EGFR蛋白水平（图3D）。KEGG富集分析表明，OTUD4沉默后PI3K/AKT通路下调（图3C）。此外，western blot结果显示，OTUD4敲除后，关键EGFR/PI3K/AKT通路组分的总磷酸化水平降低（图3E），而OTUD4过表达激活了该通路（图3F）。为了证实OTUD4通过EGFR发挥其致癌作用，我们进行了挽救实验。在OTUD4过表达的细胞中，EGFR的敲低消除了OTUD4过表达的促肿瘤作用（图3G-I）。在蛋白水平上，EGFR敲低抵消了OTUD4诱导的EGFR稳定，而OTUD4的稳定性不受EGFR敲低的影响（图3J）。这些结果表明OTUD4通过EGFR激活PI3K/AKT通路促进TNBC进展。

4）OTUD4和EGFR之间的相互作用是TNBC进展的驱动因素

   为了鉴定EGFR/PI3K/ AKT通路中受OTUD4影响的靶基因，我们进行了免疫沉淀，然后进行了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定OTUD4相互作用蛋白（图4A）。分析显示EGFR是OTUD4的潜在结合伙伴（图4B）。鉴于这种相互作用，我们假设OTUD4通过EGFR调节PI3K/AKT通路。共免疫沉淀实验证实了TNBC细胞中内源性OTUD4-EGFR相互作用（图4C，D），而IF分析显示OTUD4和EGFR共定位（图4E）。为了进一步描绘它们的特异性结合区域，我们构建了带有标记为OTUD4 Flag的截断和缺失变体的质粒：全长1- 1114aa，1-449aa, 450-1114aa，Δ1-155aa，Δ568-1114aa和myc标记的EGFR截断和缺失：1-1210aa，Δ621- 1210aa，958-1210aa，645-957aa。在HEK-293T细胞中转染后，随后的CO-IP分析证实了OTUD4 （568-1114aa）和EGFR （958- 1210aa）之间的相互作用
（图4F，G）。

5）OTUD4通过去泛素化稳定EGFR表达

   为了研究OTUD4调控EGFR表达的机制，我们考虑了它作为去泛素化酶的作用及其对EGFR蛋白稳定性的潜在影响。鉴于已报道的EGFR半衰期，我们进行了CHX追踪试验来评估EGFR随时间的降解。结果显示，OTUD4敲除显著降低了EGFR的半衰期（图5A，B）。然而，RT-qPCR分析证实，OTUD4敲低并未改变EGFR mRNA水平（图5C）。为了进一步探讨这一点，我们用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，观察到MG132恢复了OTUD4-敲除细胞中的EGFR蛋白水平（图5D）。此外，泛素化实验表明MG32稳定的EGFP泛素化（图5E）。OTUD4过表达特异性地降低了k48连接的EGFR多泛素化，而不影响K63连接的泛素化（图5F，G）。为了确定EGFR去泛素化的功能域，我们使用OTUD4截断结构进行了泛素化分析。结果表明，全长OTUD4及其549-1114aa区可有效降低EGFR泛素化。我们推测568-1114aa区域对于OTUD4介导的EGFR去泛素化至关重要（图5H）。

6）NRP1招募OTUD4去泛素化EGFR

   质谱分析发现NRP1是潜在的OTUD4相互作用因子（图4A，B）。先前的研究报道了NRP1敲低可降低TNBC中的EGFR蛋白和磷酸化水平，但其潜在机制尚不清楚。我们证实了这一发现，表明TNBC细胞系中NRP1下调导致EGFR和p-EGFR蛋白水平下降（图6A）。相关分析进一步证实OTUD4与NRP1在TNBC中的表达呈正相关（图6B）。CO-IP实验证实了OTUD4和NRP1之间的相互作用（图4C，D，6C，D）， IF分析显示它们在细胞质中共定位（图4E）。这些发现表明，OTUD4除了在去泛素化EGFR中的独立作用外，还可能被NRP1招募来稳定EGFR的表达。为了评估NRP1对EGFR稳定性的影响，我们进行了泛素化实验。CHX追逐实验显示，与对照组相比，NRP1-敲除TNBC细胞中EGFR的半衰期明显缩短，但不影响OTUD4的表达（图6F-G）。RT-qPCR分析证实NRP1在mRNA水平上不调节EGFR（图6H）。此外，MG132处理恢复了EGFR的稳定性（图6I）。免疫沉淀和Western blot分析进一步表明，OTUD4介导的NRP1依赖性去泛素化调节EGFR的稳定性（图6J）。这些结果表明NRP1招募OTUD4介导EGFR去泛素化。

7）OTUD4通过EGFR/ PI3K/AKT通路促进TNBC在体内的增殖

   为了评估OTUD4在TNBC体内增殖中的作用，我们将稳定的SHNC、SHOTUD4#1和SHOTUD4# 2 MDA-MB-231细胞皮下注射到雌性裸鼠腋下。肿瘤生长测量显示，OTUD4敲低显著抑制肿瘤进展（图7A-C）。免疫组织化学分析显示，与对照组相比，OTUD4敲除肿瘤中OTUD4、EGFR、PI3K、AKT、mTOR和Ki67的表达降低，表明OTUD4通过EGFR介导的PI3K/AKT途径促进TNBC肿瘤生长（图7D）。

结论：

   OTUD4 在TNBC中过表达，并通过稳定EGFR增强其侵袭性，从而激活 PI3K/AKT 信号通路。OTUD4 通过直接去泛素化以及通过NRP1的招募来稳定 EGFR，为TNBC中EGFR的调控提供了新的见解。这些发现为未来针对OTUD4 的治疗策略提供了理论支持。

参考文献：

Ren Y, Zhou F, Tan Z, Yang S, Zhang S, Zhang Y, Fu Y, Zhang M, Liu S. OTUD4 deubiquitination stabilizes EGFR and activates the PI3K/AKT pathway to promote the invasiveness of triple-negative breast cancer. Cell Death Dis. 2026 Feb 23;17(1):245. doi: 10.1038/s41419-026-08482-x.