MVP通过靶向IRF1并增强FSP1活性抑制甲型流感病毒诱导的铁死亡

   我们既往研究显示，主要穹窿蛋白（MVP）是一种参与先天免疫反应的病毒诱导宿主因子。然而，关于MVP在甲型流感病毒（IAV）诱导的铁死亡中的作用知之甚少。本研究发现，在IAV感染患者的外周血单核细胞中，MVP的表达与干扰素调节因子1（IRF1）和铁死亡抑制蛋白1（FSP1）的表达呈正相关，但与谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）无关。体外和体内实验证据表明，MVP是IAV感染过程中抵抗铁死亡的关键因子。通过研究其作用机制，发现MVP能够将IRF1从肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）分离，从而抑制其多聚泛素化和核定位。因此，IRF1对FSP1启动子的转录抑制作用被解除，进而增强FSP1表达。MVP对IAV诱导铁死亡的调控还存在第二波机制：在MVP存在下，转录诱导的FSP1从IRF1释放，导致其泛素化和肉豆蔻酰化，使其能够募集到质膜上，在那里发挥氧化还原酶的功能。这些发现定义了IAV感染过程中的一条铁死亡抑制通路。本文于2026年3月发表于《Advanced science》, IF 14.1.

图形摘要

主要实验结果

1 在IAV感染患者中，MVP表达与IRF1和FSP1的表达相关

   既往研究报道了铁死亡与IAV感染之间存在联系，这引发了一个问题：宿主如何利用铁死亡来调控IAV感染。为了研究IAV诱导铁死亡的机制，我们首先检测了IAV感染后铁死亡标志物的水平。通过细胞死亡和活力测定，我们发现IAV A/WSN/33（H1N1）病毒感染以剂量依赖性方式增加细胞死亡并降低细胞活力。为了比较IAV感染过程中细胞死亡和活力的形式，我们采用了一系列药理学方法，包括铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1， Fer-1）、凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）和坏死性凋亡抑制剂（Necrostatin-1）。Fer-1、Z-VAD-FMK或Necrostatin-1处理可挽救IAV调节的细胞死亡和活力，表明在IAV感染过程中，铁死亡与凋亡和坏死性凋亡同等重要。铁死亡是一种独特类型的程序性细胞死亡，其特征是脂质过氧化；ROS释放；GSH耗竭；以及SLC7A11、FSP1、前列腺素-内过氧化物合酶2（PTGS2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶1（CHAC1）的表达。正如预期，IAV感染后细胞内脂质过氧化和Fe2+水平升高，而GSH水平降低。Ferrostatin-1处理抑制了IAV介导的铁死亡特征诱导。同样，在IAV感染期间，CHAC1和ACSL4表达增加，而FSP1和SLC7A11表达降低。有趣的是，IAV感染不影响GPX4的表达，表明GPX4介导的铁死亡不是IAV感染期间的主要途径。接下来，我们研究了IAV是否在体内诱导铁死亡。IAV感染增加了Fe2+浓度、4-羟基壬烯醛（4-HNE）染色和Ptgs2表达，而ferrostatin-1处理抑制了IAV诱导的Fe2+浓度、4-HNE染色和Ptgs2表达。在本手稿中，为避免小鼠和人类基因混淆，小鼠基因名称用斜体表示，首字母大写，而小鼠和人类蛋白以及人类基因的名称则首字母大写。

   为阐明IAV调控铁死亡的机制，我们获取了健康个体（HI）和确诊IAV感染患者的血液样本。研究了两个独立的队列：HI和IAV感染患者。队列#1包括来自HI（n = 20）和IAV感染患者（n = 24）的外周血单核细胞（PBMC）和血清。队列#2包括来自HI（n = 14）和IAV感染患者（n = 14）的PBMC。与上述体外和体内数据一致，在队列#1中，IAV感染患者血清中的Fe2+浓度和PBMC中的脂质过氧化水平均高于HI（图1A， B）。接下来，我们使用qPCR检测了队列#1 PBMC中铁死亡标志物的表达。相应地，与HI相比，IAV感染患者中FSP-1和SLC40A1的mRNA水平降低（图1C， D）。然而，与HI相比，IAV感染患者中GPX4和SLC7A11的mRNA水平变化轻微，再次验证了GPX4不参与IAV调控的铁死亡（图1E， F）。我们及其他研究者此前曾报道，MVP和IRF1是IAV感染过程中先天免疫和炎症反应中的两个重要基因。一致地，IAV感染患者中MVP和IRF1的mRNA水平高于HI（图1G， H）。在IAV感染患者中，升高的MVP表达与FSP1和IRF1的表达呈正相关，但与GPX4和SLC40A1的表达无关（图1I–L）。在上述队列#2中，使用Western blot评估了铁死亡标志物的蛋白水平。结果显示，与HI相比，IAV感染患者中FSP1蛋白水平降低，而MVP和IRF1蛋白水平升高（图1M–T）。正如预期，与HI相比，IAV感染患者中GPX4和SLC7A11的蛋白水平变化轻微（图1M–T）。总之，这些发现表明MVP/IRF1/FSP1轴在IAV感染过程中的铁死亡调控中发挥重要作用。

图1 IAV感染患者铁死亡、MVP和IRF1表达分析

2 MVP是IAV诱导铁死亡的有效抑制因子

   为了研究MVP在体外对IAV诱导铁死亡的影响，我们构建了pCMV-MVP过表达质粒和MVP特异性短发夹RNA（shRNA），并验证了它们的效率。如下所述，选择shRNA-MVP#3用于MVP敲低实验。与我们既往结果一致，IAV感染以剂量依赖性方式诱导MVP的mRNA和蛋白水平。相反，MVP敲低增加了IAV复制。接下来，我们检测了MVP对IAV诱导铁死亡的影响。MVP敲低增强了IAV诱导的脂质过氧化和Fe2+积累，同时降低了IAV抑制的GSH水平和细胞活力（图2A）。相比之下，MVP过表达抑制了IAV诱导的脂质过氧化和Fe2+积累，同时提高了IAV抑制的GSH水平和细胞活力（图2B）。

图2 MVP在体外和体内抑制IAV诱导的铁死亡

   为了研究MVP在体内对IAV诱导铁死亡的影响，我们使用了如前所述的MVP敲除（Mvp-/-）小鼠模型。与野生型（Wt）小鼠相比，Mvp-/-小鼠在IAV感染期间肺组织中表现出更高水平的Fe2+、4-HNE染色和肺部炎症（图2C–F）。正如预期，在IAV感染期间，Mvp-/-小鼠肺组织中的Ptgs2 mRNA水平和IAV病毒滴度高于Wt小鼠（图2G， H）。总之，这些发现表明MVP是IAV诱导铁死亡的负调控因子。

3 MVP通过与IRF1相互作用负向调控铁死亡

   我们既往的研究表明，MVP通过与IRF2结合促进肝细胞癌。在IRF家族中，IRF1已被广泛报道可调控铁死亡。本研究中，我们发现IAV患者PBMC中MVP表达与IRF1表达相关。因此，我们推测MVP在响应IAV感染时与IRF1相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）和反向Co-IP实验显示，Flag标签的MVP与HA标签的IRF1相互作用（图3A）。在我们既往的研究中，我们发现MVP不与p53相互作用。因此，纳入p53作为阴性对照进行比较（图3B）。通过免疫荧光染色，我们还显示MVP在A549和293T细胞中与IRF1共定位（图3C， D）。为了定位IRF1与MVP相互作用的区域，我们构建了一系列IRF1截短突变体。我们证明IRF1的DNA结合域（DBD）（氨基酸1-115）是其与MVP相互作用所必需的（图3E）。

图3 MVP与IRF1结合以抑制IAV诱导的铁死亡

   由于MVP与IRF1结合，我们研究了MVP/IRF1轴在IAV诱导铁死亡中的作用。IAV感染以剂量依赖性方式增加IRF1的mRNA和蛋白表达水平。为了研究IRF1对IAV诱导铁死亡的影响，我们构建了pCMV-IRF1过表达质粒和IRF1特异性shRNA，并测试了它们的效率。选择shRNA-IRF1#1用于下文所述的IRF1敲低实验。结果表明，在IAV感染期间，IRF1敲低降低了Fe2+水平和脂质过氧化，但增加了GSH水平和细胞活力（图3F）。相反，在IAV感染期间，IRF1过表达提高了Fe2+和脂质过氧化水平，但抑制了GSH水平和细胞活力（图3G）。有趣的是，在IAV感染期间，IRF1敲低消除了MVP shRNA对脂质过氧化水平、Fe2+水平、GSH水平和细胞活力的影响（图3H）。相比之下，IRF1过表达恢复了MVP对IAV感染期间脂质过氧化水平和Fe2+水平的抑制作用，表明IRF1是MVP介导信号传导中的下游信号分子（图3I）。总之，这些发现表明IAV感染促进了MVP与IRF1的结合，从而抑制了IRF1的促铁死亡功能。

4 MVP通过破坏IRF1/TRAF6相互作用抑制IRF1的多聚泛素化

   由于MVP与IRF1结合，我们接下来研究了MVP对IRF1表达的作用。MVP敲低不影响IRF1 RNA水平，但降低了IRF1蛋白水平（图4A， B）。我们推测MVP通过泛素-蛋白酶体系统调控IRF1的稳定性。正如预期，蛋白酶体抑制剂MG132增加了IAV诱导的IRF1蛋白水平，但不影响IAV诱导的IRF1 mRNA水平（图4C–E）。纳入自噬抑制剂氯喹（CQ）作为阴性对照进行比较（图4C–E）。在过表达系统中，MVP抑制了IRF1的多聚泛素化（图4F， G）。同样，与Wt小鼠相比，IAV在Mvp-/-小鼠中引起的IRF1多聚泛素化水平较低（图4H， I）。通过UbiBrowser，我们确定TRAF6是负责IRF1多聚泛素化的潜在E3泛素连接酶。Co-IP和反向Co-IP实验显示，TRAF6与MVP和IRF1均存在相互作用（图4J， K）。使用IAV感染小鼠模型获得了类似结果（图4L， M）。进一步实验表明，TRAF6增强了IRF1的K48连接多聚泛素化，但不增强K63连接或K48R连接的多聚泛素化（图4N， O）。有趣的是，MVP抑制了TRAF6介导的IRF1多聚泛素化（图4P， Q）。为了探索此事件的潜在机制，进行了竞争性Co-IP实验。用递增剂量的MVP编码质粒转染破坏了TRAF6和IRF1的相互作用。相反，IRF1以剂量依赖性方式破坏了MVP/TRAF6的相互作用（图4T， U）。总之，这些发现表明MVP通过与TRAF6竞争性结合来抑制IRF1的多聚泛素化。

图4 MVP通过与TRAF6竞争性结合抑制IRF1的K48连接多聚泛素化

5 MVP/IRF1轴在IAV感染期间调控FSP1的表达与定位

   由于MVP与IRF1结合以调控IAV诱导的铁死亡，我们探究了MVP/IRF1轴下游信号通路中涉及哪个铁死亡相关分子。ENCODE染色质免疫沉淀（ChIP）-seq数据库显示，FSP1启动子具有两个潜在的IRF1结合位点（RE1-2）。与此一致，IRF1敲低增加了FSP1的mRNA和蛋白水平。同时，在IAV感染期间，过表达IRF1降低了FSP1的mRNA和蛋白水平。为了研究MVP和IRF1在FSP1调控中的作用，我们用MVP/IRF1过表达质粒和pFSP1-Luc（包含-2000至+100 bp的FSP1启动子区域）共转染293T细胞。荧光素酶活性测定表明，IRF1过表达降低FSP1启动子活性，而MVP过表达则增加其活性。ChIP-qPCR检测显示，IRF1结合到FSP1启动子的RE1和RE2位点，而MVP抑制IRF1与FSP1启动子的结合。这些数据表明IRF1是FSP1转录的负调控因子。

   既往研究表明，FSP1的亚细胞定位决定其抑制铁死亡的能力。为了探究IAV感染是否影响FSP1的亚细胞定位，我们使用了标记质膜的亲脂性示踪剂DiI。在未感染细胞中，FSP1定位于细胞膜，但在IAV感染后，其细胞膜定位减少（图5A）。令人惊讶的是，在IAV感染期间，FSP1与MVP和IRF1共定位（图5B， C）。用GFP-FSP1、mCherry-IRF1或mCherry-MVP转染也获得了类似结果（图5D， E）。有趣的是，IRF1敲低促进FSP1向质膜转位。IRF1过表达则限制了FSP1向质膜转位（图5F， G）。用已证实定位于细胞膜的蛋白mCherry-Lyn11也获得了类似结果（图5H， I）。同时，MVP敲低限制了FSP1向质膜转位。相反，MVP过表达促进了FSP1向质膜转位（图5J–M）。

图5 MVP/IRF1轴在IAV感染期间调控FSP1的表达与定位

   鉴于免疫荧光染色实验提示IAV感染期间FSP1与MVP和IRF1共定位，我们推测MVP和IRF1与FSP1竞争性结合。与免疫荧光染色结果一致，Co-IP和反向Co-IP实验显示IRF1和MVP均与FSP1相互作用。竞争性Co-IP实验表明，IRF1破坏了MVP/FSP1的相互作用，而MVP破坏了IRF1/FSP1的相互作用。内源性Co-IP结果表明，在未刺激细胞中MVP与IRF1结合，而这种结合在IAV感染24小时后被破坏。相反，在未刺激细胞中MVP与FSP1结合较弱，而在IAV刺激后这种结合增强。总之，这些发现表明MVP/IRF1通过两种机制调控FSP1功能。其一，MVP通过泛素化降解IRF1来促进FSP1表达，从而使IRF1无法结合FSP1启动子。其二，MVP通过解除FSP1与IRF1之间的相互作用，促进FSP1向质膜转位。

6 MVP/IRF1轴通过调控FSP1的泛素化和肉豆蔻酰化影响FSP1的定位

   既往研究表明，FSP1的肉豆蔻酰化和TRIM21介导的K63连接泛素化影响其细胞膜定位。接下来，我们试图确定MVP/IRF1轴是否调控FSP1的泛素化和肉豆蔻酰化。IRF1过表达降低了FSP1的泛素化，而MVP过表达则轻微降低FSP1的泛素化（图6A， B）。研究表明，IRF1过表达抑制了FSP1的K63连接泛素化（图6C， D）。使用点击化学检测FSP1的肉豆蔻酰化。IAV感染抑制了FSP1的肉豆蔻酰化。使用N-肉豆蔻酰转移酶（NMT）抑制剂（ddd85646， iNMT）作为阳性对照。该实验表明，IAV降低了FSP1的肉豆蔻酰化，而这种降低可被IRF1敲低逆转（图6E， F）。相反，IRF1过表达抑制了FSP1的肉豆蔻酰化，并且IRF1过表达与IAV感染协同抑制FSP1的肉豆蔻酰化（图6G， H）。MVP敲低协同增强了IAV对FSP1肉豆蔻酰化的抑制作用（图6I， J）。此外，IAV降低的FSP1肉豆蔻酰化可通过MVP过表达恢复（图6K， L）。值得注意的是，iNMT处理消除了MVP、IRF1和IAV对FSP1膜定位的影响（图6M–P）。

图6 MVP/IRF1轴调控FSP1的泛素化和肉豆蔻酰化

   接下来，我们研究了MVP/IRF1轴调控FSP1肉豆蔻酰化和泛素化的机制。FSP1与NMT2和TRIM21相互作用，但不与NMT1相互作用。同样，IRF1和MVP也与NMT2和TRIM21相互作用，但不与NMT1相互作用。既往研究表明，FSP1点突变体（G2A）无法被肉豆蔻酰化。MVP敲低抑制了FSP1向质膜转位，而MVP过表达促进了FSP1向质膜转位（图6Q， R）。然而，MVP不影响FSP1-G2A向质膜转位（图6Q， R）。一致地，NMT2敲低抑制了FSP1向质膜转位，而NMT2过表达促进了FSP1向质膜转位（图6S， T）。然而，NMT2不影响FSP1-G2A向质膜转位（图6S， T）。进一步研究表明，在NMT2敲低细胞中，敲低或过表达MVP对FSP1转位无显著影响，表明MVP通过NMT2促进FSP1向质膜转位（图6U， V）。

   我们研究了FSP1肉豆蔻酰化与泛素化之间的关系。TRIM21敲低抑制了FSP1的肉豆蔻酰化。既往研究表明，FSP1点突变体（K366R）无法被泛素化。正如预期，与转染FSP1 WT的细胞相比，转染FSP1 K366R的细胞中FSP1的肉豆蔻酰化受到抑制。接下来，我们研究了FSP1肉豆蔻酰化对其泛素化的影响。iNMT处理和NMT2敲低均不影响FSP1的泛素化。一致地，FSP1 G2A也不影响FSP1的泛素化。总之，这些发现表明，MVP通过与IRF1竞争性结合，招募TRIM21和FSP1，导致FSP1泛素化。随后，泛素化的FSP1与NMT2相互作用，导致FSP1肉豆蔻酰化。最终，FSP1转位至细胞膜。

7 MVP/IRF1轴通过FSP1调控IAV诱导的铁死亡

   为了验证IRF1是否通过FSP1调控IAV诱导的铁死亡，我们合成了FSP1 shRNA并评估了其效率。如下所述，选择shRNA-FSP1#3用于FSP1敲低实验。FSP1敲低或FSP1抑制剂（iFSP1）处理消除了IRF1敲低对IAV感染期间Fe2+水平、脂质过氧化和GSH的调控作用（图7A）。在IRF1过表达系统中获得了类似结果（图7B）。一致地，FSP1敲低或iFSP1处理消除了MVP敲低或MVP过表达对IAV感染期间Fe2+水平、脂质过氧化和GSH的调控作用（图7C， D）。同样，IAV降低了FSP1氧化还原酶活性，而MVP过表达则恢复了其活性（图7E）。

图7 MVP和IRF1通过FSP1调控IAV诱导的铁死亡

   接下来，我们研究了MVP/IRF1轴是否在体内通过FSP1调控IAV诱导的铁死亡。鉴于iFSP1不能用于体内治疗，且FSP1和CoQ在同一通路中发挥抑制铁死亡的作用，我们采用了CoQ生物合成抑制剂（4-CBA）来抑制FSP1功能。如图7F， G所示，4-CBA处理增加了IAV诱导的肺组织中Fe2+和4-HNE水平，以及PBMC中的脂质过氧化水平。接着，我们在体内验证了MVP是否通过FSP1调控IAV诱导的铁死亡。如图7H， I所示，在4-CBA处理的小鼠中，MVP敲除不影响IAV诱导的肺组织中Fe2+或4-HNE水平，也不改变PBMC中的脂质过氧化水平。这些发现表明，FSP1是IAV感染期间MVP/IRF1轴调控铁死亡过程中的下游信号分子。

8 MVP/IRF1/FSP1轴直接调控IAV诱导的铁死亡

   由于MVP通过诱导IFN抑制病毒复制，因此MVP可能通过影响IAV复制来调控IAV诱导的铁死亡。为了解决这个问题，我们采用了两种方法。其一，研究MVP在因基因组缺失而缺乏I型IFN的Vero细胞中对IAV诱导铁死亡的作用。与我们既往结果一致，在Vero细胞中过表达或敲低MVP不影响IAV复制。其二，调整IAV初始感染剂量，以确保MVP敲低或过表达细胞中的IAV复制水平与对照细胞相同（下文称为调整系统）。结果表明，IAV（感染剂量，MOI = 0.09）在sh-control转染的A549细胞中的复制与IAV（感染剂量，MOI = 0.05）在sh-MVP转染的A549细胞中的复制相同。类似地，IAV（感染剂量，MOI = 0.05）在对照载体转染的A549细胞中的复制与IAV（感染剂量，MOI = 0.09）在pCMV-MVP转染的A549细胞中的复制相同。重要的是，在Vero细胞或调整系统中，MVP敲低仍然增加了IAV诱导的脂质过氧化和Fe2+积累，同时降低了IAV抑制的GSH水平和细胞活力。相比之下，在Vero细胞或调整系统中，MVP过表达抑制了IAV诱导的脂质过氧化和Fe2+积累，同时增强了IAV抑制的GSH水平和细胞活力。

   接下来，我们研究了IRF1/FSP1是否通过影响IAV复制来调控IAV诱导的铁死亡。IRF1敲低（而非FSP1敲低或4-CBA处理）促进了IAV的复制。因此，我们选择IRF1进行进一步研究。IAV（感染剂量，MOI = 0.1）在sh-control转染的A549细胞中的复制与IAV（感染剂量，MOI = 0.04）在sh-IRF1转染的A549细胞中的复制相同。类似地，IAV（感染剂量，MOI = 0.02）在对照载体转染的A549细胞中的复制与IAV（感染剂量，MOI = 0.1）在pCMV-IRF1转染的A549细胞中的复制相同。值得注意的是，在调整系统中，IRF1敲低降低了IAV感染期间的Fe2+水平和脂质过氧化，但增加了GSH水平和细胞活力。类似地，在调整系统中，IRF1过表达提高了IAV感染期间的Fe2+和脂质过氧化水平，但抑制了GSH水平和细胞活力。

   最后，我们研究了MVP/IRF1轴是否通过影响IAV复制来调控IAV调节的FSP1肉豆蔻酰化。在调整系统中，敲低IRF1恢复了IAV对FSP1肉豆蔻酰化的抑制作用，而过表达IRF1则增强了IAV对FSP1肉豆蔻酰化的抑制作用。正如预期，在Vero细胞或调整系统中，MVP敲低协同增强了IAV降低的FSP1肉豆蔻酰化；MVP过表达恢复了被IAV抑制的FSP1肉豆蔻酰化（图S10E–L）。这些发现表明，MVP/IRF1/FSP1轴直接调控IAV诱导的铁死亡，而非通过调控IAV复制来实现。

参考文献：

Chen Y, Lin P, Xia Y, Liu Z, Cheng Z, Zhu Q, Wan S, Chen X, Bao H, Qiao R, Zhong G, Zhu Y, Liu S. MVP Inhibits Influenza A Virus-Induced Ferroptosis by Targeting IRF1 and Increasing FSP1 Activity. Adv Sci (Weinh). 2026 Mar 4:e20371. doi: 10.1002/advs.202520371. Epub ahead of print. PMID: 41782382.