抑制低氧外泌体miR-423-3p通过限制星形胶质细胞的自噬来减少胶质瘤的进展

         胶质瘤的肿瘤微环境（TME）包括胶质瘤细胞和周围的细胞，如星形细胞、巨噬细胞、T细胞和神经元。在TME中，胶质瘤细胞可以通过分泌外泌体来激活正常人类星形细胞（NHAs），而星形细胞的激活可以进一步促进胶质瘤的进展，导致患者预后不良。然而，胶质瘤激活NHAs的分子机制在很大程度上仍然未知。在这项研究中，胶质瘤衍生的外泌体（GDEs）在调节自噬和激活NHAs中起着重要作用。与常氧GDEs相比，缺氧胶质瘤衍生的外泌体（H-GDEs）进一步改善了星形细胞的自噬和激活，这极大地促进了胶质瘤细胞的进展。在来自胶质瘤的两种外泌体之间的miRNA阵列中，miR-423-3p在H-GDEs中高表达，并在自噬中发挥了重要作用，导致NHAs的激活。确定了缺氧胶质瘤细胞与NHAs反应以创建免疫抑制微环境的机制，并建立了15d-PGJ2作为抑制miR-423-3p以抑制NHAs激活的有效抑制剂。这些发现为通过靶向自噬和miR-423-3p表达提供了对胶质瘤诊断和治疗的新见解。本文于2025年4月发表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技术路线：

结果：

1）H-GDEs诱导体外NHAs细胞自噬

         为了研究GDEs对星形细胞功能的影响，从在常氧（N-GDEs）和缺氧（H-GDEs）条件下培养的U251和P3#GBM细胞中提取了GDEs。透射电子显微镜（TEM）显示，从上清液中提取的内容物是直径为30-100 nm的圆形物体（图1A），这表明外泌体的成功提取。此外，Western blotting显示，在提取的囊泡中，外泌体标记物的表达丰富，包括CD9和TSG101，而calnexin未被检测到（图1B）。由于假设缺陷自噬会触发反应性星形细胞，因此研究了GDEs对星形细胞中自噬的影响。使用TEM测量自噬体的形成。与N-GDE处理相比，H-GDE处理后的自噬体体积显著增加（图1C，D）。使用Western blotting检测NHA中与自噬相关的分子LC3B和P62的表达（图1E）。N-GDEs和H-GDEs均增加了NHA中的自噬，其中H-GDEs处理的星形细胞中自噬增加更为显著，这表明GDEs直接影响星形细胞中的自噬。同样，根据免疫荧光染色，星形细胞在暴露于来自U251和P3#GBM（图1F）的H-GDEs后，其内的LC3B增加。使用3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬减弱了H-GDE处理的NHA中LC3B的表达，进一步证实H-GDEs促进星形细胞中的自噬（图1G）。此外，进行了siRNA介导的beclin1敲除，并使用Western blotting验证了这种敲除的有效性作为抑制自噬的替代方法。与3-MA处理一致，beclin1的敲除导致LC3B类似的下调（图1H）。值得注意的是，3-MA和beclin1沉默均有效逆转了H-GDE诱导的自噬体组装（图1I，J）。此外，Western blotting显示，在使用这些抑制剂治疗后，LC3B的表达如预期的那样下调，同时P62的表达上调（图1K）。总的来说，这些发现强调了H-GDEs诱导星形胶质细胞自噬的能力。

2）H-GDEs比N-GDEs更能诱导NHAs活化

         鉴于GDEs可以诱导NHA中的自噬，因此确定了GDEs对星形细胞功能的后续影响。使用EdU和Transwell测定，我们发现N-GDEs和H-GDEs均增强了NHA的增殖和迁移，其中H-GDEs的效果比N-GDEs更强（图2A，C，E）。ELISA显示，NHA增殖和迁移的增加伴随着H-GDE处理的细胞中IL-6和IL-8分泌的显著增加（图2I）。GFAP是反应性星形细胞的经典标记物，因此，在用N-GDEs和H-GDEs处理后评估了GFAP的表达。研究结果显示，NHA在暴露于H-GDEs后，GFAP表达显著上调（图1G），证实了H-GDEs在星形细胞激活中的强效前反应作用。接下来，研究了自噬是否在这一转变中发挥作用。在H-GDE处理的组中，通过3-MA抑制自噬或敲低beclin1减弱了H-GDE诱导的IL-6和IL-8的分泌（图2J）。然后研究了GDEs暴露后NHA中观察到的功能变化是否由自噬介导。EdU和Transwell测定还显示，自噬的下调阻断了H-GDEs对NHA增殖和迁移的影响（图2B，D，F）。此外，Western blotting揭示，通过3-MA或beclin1的基因敲低实现的抑制自噬，导致GFAP表达显著降低（图2G）。总的来说，这些结果强烈表明H-GDEs可以通过调节自噬诱导NHA转变为反应表型。

3）H-GDEs通过miR-423-3p诱导NHAs细胞自噬，其作用可被3-MA抑制

         外泌体可以在细胞之间运输miRNAs 。为了确定导致NHA转化的GDE相关的miRNA，使用miRNA阵列分析了来自U251和P3#GBM细胞的N-GDEs和H-GDEs中的miRNA含量（图3A）。比较了N-GDEs和H-GDEs中差异表达的miRNA，并鉴定了从两种细胞系中提取的H-GDEs中高表达的top 10 miRNA（图3B）。确定了这10个miRNA对NHA中自噬调节的影响。MiR-423-3p显著提高了NHA中LC3B的表达，通过半定量测量（图3C，D），表明其在调节自噬中的重要作用。对来自P3#GBM细胞（图3E）的N-GDEs和H-GDEs进行了qRT-PCR，证实了miR-423-3p的上调。此外，与来自健康患者的血液中收集的外泌体相比，来自GBM患者的血液中收集的外泌体的表达水平更高（图3F）。Western blotting和免疫荧光图像显示，miR-423-3p增加了NHA中的自噬（图3G，I）。当在miR-423-3p转染的细胞中敲低beclin1时，观察到了相同的趋势（图3H，I），表明了miR-423-3p的自噬诱导效应。鉴于miRNA-423-3p可以诱导自噬，研究了miR-423-3p是否介导GDEs对自噬的影响。与对照相比，提取的GDEs显著上调了NHA中的LC3B（图3J，L），并且使用针对miR-423-3p的抑制RNA消除了NHA中LC3B的上调（图3L）。LC3B的免疫荧光染色显示出了相似的结果（图3K）。在形态上，miR-423-3p诱导了自噬体的形成，这被3-MA、beclin1敲低和miRNA抑制剂所抑制（图3M，N）。总的来说，miR-423-3p在诱导NHA自噬中发挥了重要作用。

4）miR-423-3p诱导的H-GDEs自噬促进星形胶质细胞的活化

         MiR-423-3p诱导NHA中的自噬，因此，研究了miR-423-3p是否促进了星形细胞的转化。使用miR-423-3p模拟物转染NHA，并使用3-MA或beclin1敲低RNA进行自噬抑制处理。Transwell和EdU测定显示，miR-423-3p显著增加了NHA的增殖和迁移，这被自噬抑制所减弱（图4A，C，E，F）。使用ELISA和Western blotting，我们证实miR-423-3p增加了星形细胞中IL-6和IL-8的分泌（图4I），并上调了GFAP的表达（图4G）。这些结果表明miRNA-423-3p促进了NHA向RA的转变。为了进一步验证miR-423-3p是否介导GDEs对NHA转化的影响，从常氧条件下过表达miR-423-3p的P3#GBM细胞中提取GDEs来处理NHA。将含有抑制miR-423-3p的miRNA的H-GDEs添加到另一组中。MiR-423-3p显著增强了转化，而抑制RNA则挽救了H-GDE诱导的NHA转化（图4B，D-F，H，J）。总的来说，这些结果表明H-GDEs中的miR-423-3p通过自噬促进了NHA的肿瘤促进转化。

5）H-GDEs中miR-423-3p诱导的RAs在体内促进胶质瘤的进展

         鉴于胶质瘤细胞可以通过外泌体机制诱导NHA向RA的转变，研究了GDEs或miR-423-3p诱导的星形细胞转化是否可以促进胶质瘤的进展。将用PBS、N-GDEs和H-GDEs预处理的P3#GBM细胞和星形细胞共植入裸鼠的大脑中，并通过尾静脉每3天给小鼠注射PBS、N-GDEs和H-GDEs。植入后1周和4周通过生物发光成像测量的肿瘤体积显示，与另外两组小鼠相比，用H-GDE处理的小鼠的肿瘤体积显著更大（图5A，B）。随后，用H-GDE处理的小鼠的生存时间比其他组的小鼠短（图5C）。H&E和Ki67的免疫组化染色显示，H-GDE处理组的肿瘤边界不清且Ki67表达高。还对星形细胞标记物GFAP进行了染色；用H-GDE处理的NHA表现出异形GFAP的高表达，分支数量明显增加（图5D）。此外，LC3B和GFAP的共免疫染色显示，H-GDE处理显著增加了NHA中LC3B和异常GFAP的表达（图5E），表明H-GDE可以在体内促进NHA的自噬和转化。在确认了H-GDEs在体内促进胶质瘤进展的作用后，研究了miR-423-3p对肿瘤进展的影响。将NHA用lenti-miR-control或lenti-ov-miR-423-3p病毒转染，并与P3#GBM细胞一起植入裸鼠中以生成原位异种移植。生物发光成像显示，到第4周时，miR-423-3p增加了裸鼠的肿瘤大小（图5F，G）。此外，植入小鼠的存活率低于对照组小鼠（图5H）。一致地，H&E染色显示miR过表达组中有强烈的肿瘤浸润（图5I）。此外，Ki67和GFAP的IHC染色显示，miR-423-3p诱导的NHA激活促进了胶质瘤的增殖率和NHA中异形GFAP的表达（图5I，J）。共免疫染色进一步表明，与对照小鼠相比，lenti-miR-423-3p表达小鼠的LC3B和异形GFAP水平更高（图5K）。总的来说，这些结果表明，来自H-GDEs的miR-423-3p可以促进TME中NHA向RA的转变，并随后在体内促进胶质瘤的进展。

6）LAMP3是miR-423-3p的下游靶基因，在NHAs中参与自噬

         为了检测miR-423-3p在调节自噬过程中的下游基因，我们使用了qPCR阵列来探测转染了对照和miR-423-3p模拟物的NHA细胞中与自噬相关的靶基因（图6A，B）。根据之前的研究，LAMP3可能是miR-423-3p的下游靶点，其功能与自噬密切相关。通过Western blotting比较了来自U251和P3#GBM细胞的PBS、N-GDEs和H-GDEs处理的NHA细胞中LAMP3的表达。H-GDEs显著增加了NHA细胞中LAMP3的表达（图6C）。此外，在转染了miR-423-3p的NHA细胞中，LAMP3的表达增加，当自噬被抑制时，这种趋势被逆转（图6D）。这些实验表明LAMP3可能参与了miR-423-3p对自噬诱导的影响。进一步的pull-down实验显示miR-423-3p与LAMP3之间存在直接相互作用，进一步支持了这一推测（图6E）。

7）15d-PGJ2可以抑制miR-423-3p的活性，抑制NHAs的激活

         为了识别可能抑制miR-423-3p活性的药物，我们对用miR-control或miR-423-3p处理的NHA进行了转录组测序，这使我们能够识别差异表达基因（图7A，B）。KEGG富集分析显示，差异表达基因与溶酶体功能、线粒体自噬和代谢途径相关，所有这些都与自噬有关（图7C）。此外，GO富集分析突出了外泌体和焦点黏附，有助于随后形成胶质瘤微环境（图7D）。我们使用CMap数据库基于差异表达基因预测潜在药物。预测能通过血脑屏障（BBB）的前三种药物是GDC-0879、15d-PGJ2和linsitinib（图7E）。在5 μM浓度下，15d-PGJ2对胶质瘤细胞和外泌体均表现出强效抑制作用，这使其效力与GDC-0879和linsitinib区分开来（图7F）。结合使用CCK-8测试的IC50（图7G），这些候选物的分子拓扑极性表面积和分子量，我们选择了15d-PGJ2进行以下实验。在NHA中，15d-PGJ2处理导致miR-423-3p诱导的迁移率（图7H）、GFAP水平（图7I）和增殖率（图7J）降低。随后，观察到当与用15d-PGJ2预处理的NHA共培养时，P3#GBM细胞的增殖率降低（图7K），这突出了这种化合物在复杂细胞微环境中对GBM细胞增长的潜在抗增殖效应。因此，15d-PGJ2被预测为一种有前途的抑制剂，可减少NHA的激活和TME的形成。

结论：

         这项研究揭示了一种正反馈机制，通过这种机制，胶质瘤触发星形细胞激活，而星形细胞激活反过来又促进胶质瘤的恶性程度。此外，胶质瘤通过分泌含有miR-423-3p的外泌体，促进了NHA向RA的转变，随后通过自噬诱导星形细胞反应性。

实验方法：

         Western blot，Pull down，免疫荧光，ELISA，qRT‒PCR，EdU，Transwell，CCK-8，RNA-seq，免疫组化。

参考文献：

         Tang Z, Xue Z, Liu X, Zhang Y, Zhao J, Liu J, Zhang L, Guo Q, Feng B, Wang J, Zhang D, Li X. Inhibition of hypoxic exosomal miR-423-3p decreases glioma progression by restricting autophagy in astrocytes. Cell Death Dis. 2025 Apr 8;16(1):265. doi: 10.1038/s41419-025-07576-2.