巨噬细胞源性骨桥蛋白（SPP1）保护非酒精性脂肪性肝炎

       非酒精性脂肪性肝炎（NASH）以脂肪变性、小叶炎症、肝细胞球囊变形和纤维化为特征，所有这些增加了NASH发展为终末期肝病的风险。骨桥蛋白（OPN，SPP1）在巨噬细胞（MF）中发挥重要作用，但MF衍生的OPN是否影响NASH进展是不知道的。研究分析了来自NASH患者的公开转录组数据集，并使用在髓系细胞和肝脏MFs中条件性过表达或敲除SPP1的小鼠，模拟西方饮食给予它们高脂、果糖和胆固醇饮食，以诱导NASH。本研究证明高表达SPP1的MFs在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者和小鼠中富集，并表现出代谢但非促炎特性。在髓系细胞中条件性敲除SPP1（SPP1^{KI Mye}）或在肝巨噬细胞中条件性敲除SPP1（SPP1^{KI LvMF}）可提供保护作用，而在髓系细胞中条件性敲除SPP1（SPP1^ΔMye）可加重NASH。这种保护作用是通过诱导精氨酸酶-2（ARG2），增强肝细胞中脂肪酸氧化（FAO）来介导的。ARG2的诱导源于SPP1^{KI Mye}小鼠MFs中制瘤素- M（OSM）产量的增加。OSM激活STAT3信号，从而上调ARG2。除了肝脏作用外，SPP1^{KI Mye}还通过性别特异性的肝外机制发挥保护作用。MF来源的OPN通过上调OSM，通过STAT3信号增加ARG2，从而保护NASH。进一步，ARG2介导的FAO增加减少了脂肪变性。因此，增强MFs和肝细胞之间的OPN - OSM - ARG2对话可能对NASH患者有益。本研究于2023年6月发表在期刊《Gastroenterology》上，IF=29.4。

技术路线

主要研究内容

1、Kupffer cells (KCs)中SPP1信使RNA表达较高的患者脂肪变性评分相对较低

       转录组数据集GSE135251（206位NAFLD患者）揭示了SPP1 mRNA表达与NAFLD活性评分（NAS）和纤维化评分有着显著相关性（图1A）。转录组数据集GSE126848，GSE135251和GSE167523（335位NAFLD患者）显示，45个基因均与SPP1表达相关。将这45个基因与人类scRNA seq数据集GSE136103（健康个体和肝硬化患者）进行比对，鉴定出9个在髓系细胞中表达的基因，其中3个是骨髓细胞特异性的（TREM2, MMP9, OLR1）（图1B）。scRNA seq数据集GSE136103的细胞聚类鉴定出SPP1高表达的MF集群（SPP1^High MFs），TREM2（LAM的标记物）也高表达。此外，NASH患者原发Kupffer cells（KC）的RNA-seq显示，KCs中SPP1表达较高的患者脂肪变性评分相对较低（图1C）。因此，尽管肝中SPP1 mRNA与NASH进程相关，是否MF源性的OPN保护或伤害了肝脏，需要进一步的调查。

图1- KCs中SPP1 mRNA表达较高的患者脂肪变性评分相对较低

2、在NASH病人和小鼠中，OPN蛋白表达的增加

       为证实NASH中OPN主要的细胞来源，研究分别对NASH患者肝脏进行活检，对NASH小鼠组织进行免疫染色。NASH患者的OPN染色随着纤维化分期逐渐增加，伴随着OPN ⁺ MF簇，通过免疫组织化学鉴定OPN（或SPP1）和CD68共定位（图1D）。对照组小鼠在胆管上皮细胞中OPN表达受限，周围肝细胞和非实质性肝细胞中的染色很少（图1E，top left）。NASH小鼠的肝细胞和MF中OPN表达受到诱导（图1F，bottom left），后者进一步说明了SPP1和EMR1的共定位。这些结果证实，MF增加了人类和小鼠NASH中OPN的表达。

3、OPN mRNA表达上调的MF在NASH中显示代谢表型

       为理解OPN⁺MFs的功能，研究分析了NASH小鼠的一个公共的单细胞测序数据GSE129516。MF群体的亚聚类 鉴定出5个簇（KC[1]， cyclin -KC, LAM[1]， LAM[2]，SPP1^High MFs）与对照组相比，在NASH中SPP1表达增加。其中，SPP1^High MFs中SPP1的表达最高，同时和LAM标记物（Trem2、Gpnmb、Cd9）的表达最高（图1F）。差异表达（DE）分析揭示了SPP1^High MFs具有相对较低水平的参与炎症（Il1b、S100a4）和纤维化（Tgfb）的基因，但参与脂质代谢（Cd36、Lpl、Fabp5、Fabp4、Fabp7）和细胞外基质重塑（Mmp12、Mmp13）的基因水平较高（图1F）。同样，与其他LAMs相比，这些差异在SPP1^High MFs中也被观察到；然而，与LAM[2]相比，它们的SPP1表达水平为中等水平。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）预测与其他MFs相比，SPP1^High中参与炎症的通路（白细胞外渗、IL6、HMGB1）受到抑制，但在脂质代谢（LXR / RXR、PPAR α / RXR α）中上调。这些结果表明，OPN在MFs中的上调赋予了NASH的代谢特性，而不是炎症特性。

4、髓系细胞SPP1敲入小鼠（SPP1^{KI Mye}）可预防NASH

       为了解MFs中OPN的诱导如何促进NASH进展，研究准备了SPP1^{KI Mye}小鼠。SPP1^{KI Mye}和WT小鼠用对照或NASH诱导的饮食喂养6个月。WT小鼠（雄和雌均有）发展为NASH，表现为严重的脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变，分别在靠近中央和门静脉区的微血管和大血管脂肪变性分布精细（图2A和B）。WT雄性（NAS ¼ 6.4）比雌性（NAS ¼ 4.8）表现出更严重的病理改变。与WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}的两种性别小鼠的NAS、肝体比、脂滴、肝脏TGs和胆固醇（CHO）以及谷丙转氨酶活性均显著降低 NASH（图2B - D）。值得注意的是，与WT小鼠相比，饲料对照组雄性和雌性SPP1^{KI Mye}小鼠NAS和肝脏TGs水平更低（图2B - D）。

       与SPP1^{KI Mye}相比，WT小鼠SPP1^{KI Mye}肝脏中MoMFs（CD45 α β CD11b^HighF4 / 80^LowLy6G）数量减少（图2E）。Chicken-wire纤维化存在于伴有NASH的WT小鼠中，而SPP1^{KI Mye}小鼠无此表现（图2F）。

图2-SPP1^{KI Mye}小鼠可免受NASH的侵害

5、肝脏驻留MFs中敲入SPP1的小鼠也可预防NASH

       正如Lyz2 . Cre同时靶向肝内和肝外MFs（4A），过表达SPP1小鼠（SPP1^{KI Lv MF}）仅存在于肝脏MFs中。虽然SPP1^{KI Mye}在循环的单核细胞中有显著的SPP1过表达，但在SPP1^{KI LvMF}小鼠中却没有。喂养NASH诱导饮食6个月后，H & E染色显示SPP1^{KI LvMF}小鼠免于NASH，肝体比、NAS、肝脏TGs和CHO降低。然而，与SPP1^{KI Mye}不同的是，雄性和雌性同样受到保护。因此，肝脏驻留的MFs在SPP1^{KI Mye}小鼠对NASH的保护作用中发挥主要作用。

6、骨髓细胞SPP1消融的小鼠（SPP1^ΔMye）加速发展为NASH

       为研究去除髓系细胞中的SPP1是否会加重NASH，研究构建了SPP1^ΔMye小鼠，并将其饲喂对照或NASH诱导的饮食长达6个月。研究通过H & E染色、NAS、肝脏TGs和CHO发现，与WT小鼠相比，SPP1^ΔMye加重了NASH，特别是在（1个月和3个月）的早期时间点，与6个月相比。在6个月时，肝脏有更多的炎症，表现为炎症灶增加，冠状样结构，以及Tnf和Mpo表达。因此，SPP1^ΔMye在早期时间点加速进展为NASH，并在后期增加炎症。

7、患有NASH的SPP1^{KI Mye}小鼠含有较少的饱和与单不饱和脂肪酸

       为了确定与WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}中FA代谢的变化是否对NASH具有保护作用，研究对其肝脏进行了非靶向代谢组学和脂质组学分析。从鉴定的TGs的峰强度发现，SPP1^{KI Mye}和WT小鼠之间的倍数变化（fold change，FC）与TGs的总碳原子数呈强正相关，与饱和状态呈中度相关。统计分析发现，与WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}合并NASH小鼠有35个TG发生了显著变化。在主要的变化中，大多数含有饱和脂肪酸的TGs下调，而含有超长链多不饱和脂肪酸的TGs在SPP1^{KI Mye}小鼠NASH中上调（图3A）。

图3-尿素循环增加和ARG2上调与SPP1^{KI Mye}小鼠的保护作用相关

8、由于肝细胞中Arg2表达增加，TGs减少与尿素循环上调有关

       接下来，相关性分析发现88个代谢物（图3B，聚类2）与显著降低的TGs（图3B，聚类3）呈高度负相关（平均r > 0.7）。通过Small Molecule Pathway Database对88个代谢物进行富集，提示氨循环、肉碱合成和尿素循环的上调（图3C）。事实上，无论饮食如何，SPP1^{KI Mye}小鼠的肝脏中，尿素循环的代谢物（L -鸟氨酸、L -瓜氨酸、L -延胡索酸）和下游的L -苹果酸都显著上调（图3D）。这被血清中增加的尿素和减少的氨所证实（图3E和F）。qPCR结果显示，无论饮食增加与否，Arg的线粒体亚型Arg2在SPP1^{KI Mye}小鼠肝脏中增加，而尿素循环酶几乎不受影响（图3G），并且Arg2在SPP1^ΔMye小鼠肝脏中的表达降低。免疫荧光分析发现SPP1^{KI Mye}小鼠原代肝细胞中存在ARG2的诱导表达（图3H，上）。同样，共定位研究进一步表明，在对照饮食的WT小鼠中，ARG2主要在3区的肝细胞中表达，而在NASH中，ARG2在1区和2区的肝细胞中表达增加。值得注意的是，在SPP1^{KI Mye}小鼠中，肝细胞中ARG2的上调是泛小叶（图3H，底）。因此，3-硝基酪氨酸（3-NT）残基的存在主要在肝细胞中减少（图3I），这是一种由过量NO触发的翻译后修饰，由精氨酸通过NOS2转化为瓜氨酸产生。

9、在SPP1^{KI Mye}小鼠中上调ARG2介导FAO升高

       先前的研究表明，ARG2调节线粒体动力学并保护肝脏脂肪变性。代谢组学分析显示，肉碱穿梭体的组分在SPP1^{KI Mye}小鼠肝脏中显著上调（图4A）。脂肪酸氧化（FAO）受NAD +/NADH比值的变构调节。在整个肝脏中，与WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}中NAD+/NADH比值和ATP水平显著增加（图4B和C）。Mitotracker染色显示，与WT肝细胞相比，SPP1^{KI Mye}中线粒体红色荧光较高，但结构相似（图4D）。JC - 1染色结果显示，与WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}小鼠肝细胞JC - 1聚体/单体比例增加，提示线粒体膜电位升高（图4E）。为检测棕榈酸（PA）对线粒体FAO的影响，研究监测了棕榈酸（PA）处理的肝细胞的耗氧率（OCR）。与WT小鼠相比，来自SPP1^{KI Mye}的肝细胞最小地增加了基础OCR，但增加了约2倍的最大呼吸容量和约3倍的剩余呼吸容量（图4F）。与用牛血清白蛋白和PA处理的WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}的肝细胞中ATP生成轻度增加（图4F）。值得注意的是，与使用牛血清白蛋白和PA的WT小鼠相比，来自SPP1^{KI Mye}的肝细胞中质子泄漏显著增加，在此过程中能量耗散而不产生ATP（图4F）。为确定ARG2是否介导了SPP1^{KI Mye}小鼠肝细胞中FAO的增加，研究使用小干扰RNA（siRNA）敲低Arg2，使其减少> 90 %，但不影响细胞活力。OCR检测发现，敲低Arg2显著抑制了最大呼吸容量、剩余呼吸容量和质子漏（图4G）。此外，PA处理过夜的WT与SPP1^{KI Mye}肝细胞相比，具有更多的脂滴，但用Arg2 siRNA处理后则相反。因此，在肝细胞中上调ARG2通过增加线粒体呼吸和FAO来减少脂质积累。为进一步证明ARG2在NASH中的作用，研究构建了肝细胞条件性敲除Arg2的小鼠（Arg2^ΔHep），并给予NASH诱导饮食6周。两种性别的Arg2^ΔHep均表现出比WT小鼠更严重的NASH，这归因于脂肪变性、炎症和TG的增加（图4H和I）。

图4 -上调ARG2介导SPP1^{KI Mye}小鼠的FAO升高

10、SPP1^{KI Mye}和诱导型饲料驱动了MFS中的性别特异性转录组

       为了解SPP1^{KI Mye}是否在肝脏源性的MFs中驱动特定的表型，从饲喂对照或NASH诱导饮食6个月的SPP1^{KI Mye}和WT小鼠中分选出MFs，并通过RNA seq进行转录组分析。与对照相比，在NASH的WT小鼠中观察到未报告的MF转录组性别差异。

       与WT相比，饲喂对照组SPP1^{KI Mye}雄性小鼠有362个DE基因（289个上调，73个下调），但大多数只表现出轻微的变化（FC < 2）。与WT小鼠相比，喂食NASH诱导饮食的SPP1^{KI Mye}小鼠DE基因增加到822个（736个上调，86个下调）。然而，饲喂对照或NASH诱导饮食的小鼠之间几乎没有重叠的DE基因（5个上调, 1个下调）（图5A）。Pathway分析显示，基于正Z - score，对照饮食组的DE基因富集到参与组织重塑的通路（VEGF信号，肝纤维化，凝血酶，G6P信号）（图5B）。一些炎症通路上调，而IL6和TREM1信号下调（图5B）。脂质代谢受到的影响最小（图5B）。值得注意的是，STAT3和JAK/STAT信号通路表达上调（图5B）。在NASH诱导的饮食组中观察到更强烈的与组织重塑相关的变化，表现为胶原蛋白、纤维蛋白原和凝血因子的上调（图5B和C）。在喂养NASH诱导饮食的小鼠中，SPP1^{KI Mye}对炎症的影响最小（图5B）。然而，Il1rn，Il10和Tnf表达上调，而Ccl2，Il1b和Il6不受影响。此外，SPP1^{KI Mye}有很多上调基因和通路参与脂质代谢（LXR / RXR , TG降解, FAO , PPARα / RXR α激活）和（图5B和C）。值得注意的是，尿素循环在SPP1^{KI Mye} MFs中上调，表现为Arg1、Cps1和Otc的表达量显著增加，Arg2的表达量略有增加（图5B和C）。

       DE分析发现，对照组雌性组有1026个（403个上调，623个下调）基因发生改变，而NASH诱导组雌性组基因减少到553个（256个上调，297个下调）。与雄性不同的是，对照组和饲喂NASH饮食诱导组之间的DE基因具有良好的重叠（65个上调，118个下调）（图5D）。在饲喂对照雌鼠中，组织重塑轻度下调，除TGFB信号外，大多数炎症和脂质代谢通路均下调（图5E）。STAT3信号与对照饮食的雄性SPP1^{KI Mye} MFs一样轻度上调。在NASH诱导饮食的雌鼠中，与WT小鼠（急性期反应、IL6、TNFR1信号）相比，由于细胞因子（Il1a、Il1b、Tnf、Ccl2、Ccl3、Ccl5）下调，SPP1^{KI Mye}来源的MFs有几个关键的促炎通路下调（图5E和F）。雌性SPP1^{KI Mye}小鼠中负责脂质代谢的基因和通路（Abcg5、Apoa1、Apoa2）下调（图5E和F）。虽然没有Z - score可用，但在NASH诱导饮食的小鼠SPP1^{KI Mye} MFs中，尿素循环也受到影响（图5E）。值得注意的是，2型糖尿病 信号在男性中不受影响，但在女性NASH患者的SPP1^{KI Mye} MFs中下调（图5E）。因此，SPP1^{KI Mye}驱动性别特异性效应，其在小鼠喂食控制或NASH诱导饮食也不同的作用。

图5- SPP1^{KI Mye}和喂养NASH诱导饮食驱动MFs的性别特异性转录组

11、SPP1^{KI Mye}驱动Oncostatin-M表达通过STAT3诱导Arg2

       接下来，与WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}小鼠MFs中上调的基因具有更宽的cutoff P <.05且FC>1.5（性别合并），并与已发表的小鼠分泌蛋白列表进行比较。存在16个基因（包括SPP1）编码SPP1^{KI Mye}驱动的分泌蛋白的mRNA（图5G）。

       然后，研究通过从IPA中提取分子相互作用，构建了从编码分泌蛋白的16个基因到Arg2的预测调控网络，以可视化亚细胞定位和节点连接。结果表明，6种分泌蛋白（包括OPN）可能通过53种相互作用调控Arg2的表达。制瘤素-M（OSM）、THBS1和OPN在网络中的连接度最高（图6A）。其中Osm具有最高的DE，并且可以通过STAT3，p38 MAPK和ERK潜在诱导Arg2（图6A）。为检测这种可能性，首先，研究从WT和SPP1^{KI Mye}小鼠中分离MFs，并培养72小时。SPP1^{KI Mye}小鼠的MF裂解液和培养基中OSM表达增加。然后，研究使用siRNA（附图8B ,上）在原代肝细胞中敲除OSM受体（Osmr）。最后，研究用WT和SPP1^{KI Mye} MFs的条件培养基培养WT和Osmr null肝细胞24 h。来自SPP1^{KI Mye} MFs的条件培养基增加了WT肝细胞中ARG2的表达和STAT3的磷酸化；然而，这些效应在Osmr敲除的肝细胞中被减弱（图6B和C）。在PA和SPP1^{KI Mye} MFs条件培养基的存在下，WT而不是Osmr null肝细胞具有较少的脂滴（图6C）。为进一步证实这一点，研究注射了OSM中和抗体的SPP1^{KI Mye}小鼠，发现与注射同型对照的小鼠相比，NASH加重，表现为H & E，ARG2减少，NAS，TGs和CHO增加（图6D和E）。因此，在肝细胞中，SPP1^{KI Mye}驱动OSM的表达，并通过STAT3信号增加Arg2的表达。

图6- SPP1^{KI Mye}驱动OSM的表达，OSM通过STAT3诱导Arg2

12、SPP1^{KI Mye}以性别特异性方式影响肝外FA代谢

       在肝外组织中也观察到SPP1^{KI Mye}的性别特异性效应。6个月后，男性SPP1^{KI Mye}和WT小鼠在NASH饮食中有相似的体重增加和食物摄入量，内脏脂肪组织 (VAT)增加1.5倍，脂肪细胞大小更大（图7A - D）。在VAT中，qPCR分析显示Pnpla2下调但与WT小鼠相比，Lipe在雄性SPP1^{KI Mye}小鼠中不下调（图7E）。体内脂解实验表明，注射脂解诱导剂isoprenaline后，SPP1^{KI Mye}小鼠在血清非酯化FAs中的增加较少（图7F）。即使在喂食NASH诱导的饮食之前也观察到了差异，但在雄性和雌性SPP1^{KI LvMF}小鼠中丢失了（图7F）。

       与雄性相比， NASH诱导饮食的雌性SPP1^{KI Mye}小鼠在6个月内体重增加较少（4.3 g）（图7A），VAT /体重比和脂肪细胞大小较WT小鼠降低（图7C和D）。SPP1^{KI Mye}雄性小鼠的食物摄入量相似，而SPP1^{KI Mye}雌性小鼠在NASH诱导的饮食中从2个月到4个月减少了食物摄入量，与体重增加减少相关（图7B）。患有NASH的雌性SPP1^{KI Mye}小鼠具有改善的胰岛素敏感性，在葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验中，随着时间的推移，葡萄糖降低（图7G）。在雌性SPP1^{KI Mye} VAT小鼠中，与WT小鼠相比，Pnpla2和Lipe的表达没有变化，而Leptin的表达增加，但AdipoQ的表达没有变化（图7E）。因此，雄性和雌性SPP1^{KI Mye}小鼠也受到额外的性别特异性肝外机制的保护。

图7- SPP1^{KI Mye}以性别特异性的方式影响肝外FA代谢

结论

       研究结果表明，MF来源的OPN对NASH具有保护作用。这种作用是通过上调MFs中的OSM，从而通过肝细胞中的STAT3信号增加ARG2来介导的。此外，ARG2介导的FAO增加减少了脂肪变性。因此，增强MFs和肝细胞之间的OPN - OSM - ARG2对话可能对NAFLD患者有益。

实验方法

Spp1^fl/fl小鼠，Spp1.Stop^fl/fl小鼠，免疫组织化学，免疫荧光，转录组数据分析，单细胞数据分析，通路分析，相关性分析，WB，qPCR

参考文献

Han H, Ge X, Komakula SSB, Desert R, Das S, Song Z, Chen W, Athavale D, Gaskell H, Lantvit D, Guzman G, Nieto N. Macrophage-derived Osteopontin（SPP1） Protects From Nonalcoholic Steatohepatitis. Gastroenterology. 2023 Jul;165（1）:201-217. doi: 10.1053/j.gastro.2023.03.228. Epub 2023 Apr 5. PMID: 37028770.