长链非编码RNA BC002811通过调控SOX2与PTEN启动子结合促进胃癌转移
胃癌是全球最常见的人类恶性肿瘤之一，每年有超过95万的新发病例被诊断出来，尤其在东亚和东欧。尽管在过去的几十年里，胃癌的放化疗和手术取得了一些进展，但仍有40%的胃癌患者发生转移，其中只有5%的患者生存超过5年。因此，需要进一步研究胃癌转移的分子机制，以开发新的治疗策略。越来越多的证据表明，lncRNA在各种类型癌症的增殖、凋亡、侵袭、转移、血管生成和耐药方面发挥核心作用。通过使用lncRNA芯片比较肿瘤和匹配的癌旁组织，作者之前证明了一些lncRNA在胃癌中异常表达。其中，lncRNA BC002811在胃癌组织中高表达。但BC002811在胃癌中的作用及机制有待进一步研究。该研究发表于《International Journal of Biological Sciences》，IF：10.75。
研究路线：
主要研究结果：
1. BC002811在胃癌中表达上调并与较差的生存率显著相关
在之前的研究中，作者使用lncRNA芯片比较了胃癌样本和匹配的邻近非肿瘤样本，发现BC002811在胃癌中表达上调。为了证实这一增加，作者利用组织微阵列，通过原位杂交在163对临床胃癌样本和邻近非肿瘤胃组织中评估了BC002811的表达水平。BC002811染色强度分为阴性、弱、中或强（图1A）。胃癌组织中的BC002811 ISH评分高于癌旁组织（图1B）。此外，研究发现BC002811高水平与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移相关。为了验证作者的发现，作者通过qPCR检测了BC002811在31个配对的手术切除的人胃癌/癌旁组织以及4个胃癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1中的表达。BC002811在胃癌组织中的表达始终高于相应的癌旁组织（图1C）。作者还发现，与GES-1细胞相比，BC002811在AGS、Hs746T、HGC-27和NCI-N87细胞中表达增加（图1D）。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验分析BC002811表达水平对胃癌患者总生存期（overall survival，OS）的影响，探讨BC002811表达水平与胃癌患者临床预后的关系。BC002811高表达胃癌患者的中位OS为15个月，明显短于低表达胃癌患者（图1E）。
图1lncRNA BC002811在胃癌组织中表达升高
2. BC002811在体外对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭具有显著影响
通过转染BC002811过表达载体和靶向BC002811的小干扰RNA，研究BC002811对胃癌细胞关键生物学特性的影响。MTS实验显示，敲低BC002811后，AGS和HGC-27细胞的增殖能力减弱（图2A）。与细胞增殖下降相一致，沉默BC002811的AGS和HGC-27细胞的克隆形成效率也明显低于对照组细胞（图2B）。相比之下，外源性表达BC002811可增加AGS和HGC-27细胞的增殖和集落形成（图2A-B）。流式细胞术显示，下调BC002811表达可诱导AGS和HGC-27细胞凋亡，而上调BC002811表达可降低细胞凋亡（图2C）。Transwell实验检测BC002811对细胞侵袭和迁移的影响。过表达BC002811导致迁移和侵袭细胞数量明显增加，而敲低BC002811则产生相反的结果（图2D）。BC002811的表达与胃癌细胞体外增殖、凋亡、侵袭和迁移密切相关。
图2BC002811促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制胃癌细胞凋亡
3. BC002811促进胃癌细胞体内成瘤和转移
裸鼠体内注射稳定敲低BC002811的HGC-27细胞、稳定过表达BC002811的AGS细胞和相应的对照细胞，观察BC002811对胃癌细胞体内成瘤和转移的影响。如图3A-C，与注射对照细胞的小鼠相比，注射稳定敲低BC002811细胞的小鼠显示出明显的肿瘤异种移植生长抑制。sh-BC002811组的肿瘤重量也明显低于对照组（图3D）。相反，BC002811的稳定过表达增加了肿瘤生长（图3A-D）。同样，体内尾静脉转移实验结果显示，BC002811稳定敲低组动物的肺转移较少，而BC002811稳定过表达组则相反，肺组织切片HE染色证实了这一点（图3E-H）。这些数据表明，BC002811增加了致癌活性，并在体内具有促进转移的作用。
图3BC002811在体内调节肿瘤生长和转移
4. MMP2、MMP9和PTEN是BC002811参与胃癌转移的关键下游靶点
为了进一步研究可能参与BC002811促进胃癌转移的基因，作者使用了人类肿瘤转移qPCR芯片。如图4A，在涉及人类肿瘤转移的84个关键基因中，BC002811调控了3个差异表达基因（MMP2, MMP9和PTEN）。MMP2和MMP9是众所周知的肿瘤转移标志物，而PTEN是一个特征明确的肿瘤抑制基因，在胃癌的转移中起主要作用。qPCR显示，在AGS和HGC-27细胞中过表达BC002811导致PTEN mRNA表达显著降低，MMP2和MMP9 mRNA表达显著升高，而敲低BC002811则产生相反的效果（图4B）。蛋白质印迹（图4C）和免疫组织化学检测（图4D）进一步证实了BC002811对这些基因的调控。这些结果证实了作者之前的发现，BC002811促进胃癌转移。
图4PTEN、MMP2和MMP9是BC002811的下游靶点
5. BC002811部分通过调控PTEN的表达来调控胃癌细胞的迁移和侵袭
为了探究PTEN是否参与BC002811的促进转移功能，在胃癌细胞株AGS和HGC-27中过表达PTEN。Transwell实验显示，上调PTEN抑制了AGS和HGC-27细胞的侵袭和迁移，而过表达BC002811逆转了这一作用（图5A）。与此一致，过表达BC002811还消除了PTEN介导的对MMP2/MMP9表达的抑制，以及MMP2/MMP9的酶活性（图5B-E）。由于PTEN被认为在胃癌转移的调节中具有关键功能，作者的研究结果表明，BC002811至少部分通过PTEN来调节胃癌的转移。
图5BC002811部分通过调控PTEN促进胃癌细胞的迁移和侵袭
6. BC002811通过与SOX2相互作用抑制PTEN的表达
最近的研究报道，lncRNA通过与蛋白的相互作用，通过对癌基因或肿瘤抑制基因的转录和表观遗传调控影响胃癌转移。为了探索BC002811是否通过这种方式影响胃癌细胞的转移，作者试图通过RNA pull-down实验鉴定胃癌细胞中与BC002811相关的蛋白。经SDS-PAGE和银染后，对BC002811 pull-down特异性蛋白条带进行质谱分析（图6A）。质谱分析鉴定出的主要蛋白为转录因子SOX2（图6B），这也被蛋白质印迹法证实（图6C）。为了进一步证实BC002811与SOX2之间的相互作用，作者使用SOX2抗体进行了RNA免疫沉淀。作者观察到相对于IgG对照抗体，BC002811在SOX2抗体RIP中富集(图6D)。此外，BC002811荧光原位杂交和SOX2免疫荧光显示BC002811与SOX2在AGS和HGC-27细胞核中共定位（图6E），表明BC002811可能通过与SOX2相互作用而在基因转录调控中发挥作用。PTEN是一个众所周知的肿瘤抑制基因，已被证明是胃癌中SOX2转录调控的直接靶点。为了确定BC002811是否影响SOX2与PTEN启动子的结合，染色质免疫沉淀（ChIP）和电泳迁移率移位测定（EMSA）分析在胃癌细胞中进行。ChIP检测表明，敲低BC002811增强了SOX2与PTEN启动子的结合（图6F）。这也被EMSA进一步验证（图6G）。这些结果表明，BC002811可能作为SOX2的分子诱饵，直接与SOX2结合，从而阻止SOX2与PTEN启动子结合。为了验证BC002811是否通过SOX2介导抑制PTEN的表达，作者进行了挽救实验。作者发现SOX2过表达在mRNA（图6H）和蛋白水平（图6I）逆转了BC002811介导的PTEN表达降低。然而，敲低或上调BC002811均未改变SOX2 mRNA（图6J）和蛋白表达（图6K），因此排除了BC002811通过下调SOX2表达抑制PTEN转录的作用。综上所述，这些数据表明BC002811可能通过与SOX2相互作用来抑制PTEN的转录。
图6BC002811通过充当转录因子SOX2的分子诱饵抑制PTEN的转录
7. 联合BC002811和PTEN表达可提高预后价值
作者通过免疫组化和qPCR检测PTEN在胃癌组织芯片配对样本和手术切除的胃癌样本中的表达，以评估临床样本中BC002811和PTEN水平之间的病理相关性。作者发现PTEN蛋白在胃癌组织中的表达水平低于其配对的非肿瘤胃标本（图7A-B）。同样，PTEN的mRNA水平在胃癌样本中也低于匹配的非肿瘤区域（图7C）。相关性分析发现，BC002811的表达与PTEN蛋白（图7D）和mRNA水平（图7E）呈负相关，符合BC002811对PTEN表达的调控作用。PTEN表达对胃癌患者OS影响的结果显示，PTEN低表达的胃癌患者预后稍差（图7F）。为了获得更好的临床预后，作者根据BC002811和PTEN的表达水平将胃癌患者分为4个亚组。Kaplan-Meier分析显示，这些亚组的生存模式显著不同，其中BC002811表达上调和PTEN表达下调的患者的OS低于其他亚组（图7G）。由于与低BC002811/高PTEN亚组相比，高BC002811/低PTEN亚组的OS显著降低（图7G），这表明BC002811和PTEN在胃癌预后中呈负相关。这些结果还突出了合适的胃癌预后特征的临床价值，而联合检测BC002811和PTEN表达可实现这一目标。
图7BC002811表达联合PTEN表达的预后意义
结论：
该研究鉴定出BC002811是一个参与胃癌生长和转移的致癌lncRNA。该研究结果表明，BC002811与SOX2结合，破坏SOX2与PTEN启动子之间的相互作用，从而导致PTEN转录抑制。PTEN蛋白水平的降低可进一步刺激MMP2和MMP9的表达，最终促进胃癌细胞的转移。该研究为肿瘤细胞BC002811靶向治疗胃癌转移提供了潜在的策略。
示意图：
参考文献：
Lin X, Li G, Yan X, Fu W, Ruan J, Ding H, et al. Long non-coding RNA BC002811 Promotes Gastric Cancer Metastasis by Regulating SOX2 Binding to the PTEN Promoter.Int J Biol Sci. 2023 Jan 16;19(3):967-980. doi: 10.7150/ijbs.76407.