一个新型的tRNA来源的片段AS-tDR-007333通过HSPB1/MED29和ELK4/ MED29轴促进NSCLC的恶性

肺癌是最常见的癌症类型，非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的85%。目前近年来在肺癌的诊断和治疗方法上取得了很大的进步，但NSCLC患者的5年总体生存率仍不令人满意。tRNA衍生片段(tRFs)是一种新型的小非编码RNA，由成熟或前体转移RNA (tRNAs)的特异性切割产生。在某些癌细胞中，一些tRFs与增殖、迁移和侵袭有关。然而，tRFs是否以及如何参与NSCLC的肿瘤发生仍然是一个很大的未知数。该研究发表于《Journal of Hematology & Oncology》，IF:14.136。

技术路线：

主要研究结果：

1. Circulating tRFs在NSCLC患者术前和术后血浆样本中存在差异表达

为了识别和表征在NSCLC中差异表达的Circulating tRFs，作者比较了9对来自NSCLC患者术前和术后血浆样本的tRF表达谱。tRF和tiRNA测序显示tRF表达谱在术前和术后血浆样本之间存在显著差异(图1A)。Circulating tRFs的长度在15 - 50个核苷酸(nt)之间，分别有53.97%和30.11%的tRFs在20 – 23 nt和31 – 33 nt之间(图1B)。值得注意的是，大部分术后血浆中tRFs的表达水平明显低于术前血浆样本(图1B)，提示血浆中tRFs上调与NSCLC中肿瘤的存在相关。另外，不同的tRNAs通过切割成具有相同序列的片段可以产生一种类型的tRF或tiRNA(图1C, D)。大多数血浆tRF来自tRNAs的5’端，同样，tiRNA系列更多属于tiRNA-5 (Fig. 1E, F)。

图1非小细胞肺癌患者血浆tRF谱特征

2. tRF AS-tDR-007333在NSCLC中表达上调

与术后血浆样品相比，手术前血浆样品中确定了4个上调TRF和4个下调tRF。通过qRT-PCR检测，证实AS-tDR-007333在NSCLC患者术前血浆中表达水平明显高于术后血浆标本 (图2A)。另外，NSCLC患者(n=29)和健康对照(n=45)血浆样品组的qRT-PCR分析显示，NSCLC患者血浆AS-tDR-007333浓度显著高于健康对照(图2B)。受试者工作特征(ROC)分析显示曲线下面积(AUC)为0.9379(敏感性=97.78%，特异性=79.31%)(图2C)，提示血浆AS-tDR-007333的水平具有作为诊断NSCLC生物标志物的潜力。此外，AS-tDR-007333在NSCLC细胞株(PC9、HCC827、NCI-226和A549)中的表达水平也高于正常人支气管上皮细胞(BEAS-2B)(图2D)。此外，AS-tDR-007333在NSCLC肿瘤组织中的表达水平显著高于相邻正常组织 (图2E)。综上所述，多项证据明确表明AS-tDR-007333在NSCLC中表达上调，并可能在NSCLC的发病机制中发挥关键作用。

图2 tRF AS-tDR-007333在非小细胞肺癌中表达上调，与非小细胞肺癌患者预后较差相关

3. AS-tDR-007333的高表达与NSCLC预后不良相关

为了评估AS-tDR-007333在NSCLC患者中的临床意义，用FISH法测定了AS-tDR-007333在NSCLC肿瘤组织及癌旁组织中的表达水平。结果显示AS-tDR-007333水平与TNM分期呈正相关(图2F, H)，提示AS-tDR-007333水平与NSCLC的进展相关。此外，AS-tDR-007333在细胞质中比在细胞核中更丰富(图2G)。根据AS-tDR-007333的细胞质评分分为两组(评分≥3，高表达;分数≤3，低表达)，Kaplan Meier生存分析显示，高AS-tDR-007333水平与NSCLC患者较低的总生存相关(图2I)。因此，临床资料强烈表明，高AS-tDR-007333水平与NSCLC患者不良预后相关。

4. AS-tDR-007333促进NSCLC细胞增殖和迁移

为了评估AS-tDR-007333在NSCLC中的生物学功能，在NSCLC细胞中进行了过表达和敲除实验。CCK-8实验显示过表达AS-tDR-007333显著促进细胞增殖，而敲低AStDR-007333显著抑制NSCLC细胞增殖(图3A-D)。为了验证AS-tDR-007333对NSCLC细胞增殖的影响是否反映细胞周期转变，采用流式细胞仪分析细胞周期进程。结果表明，过表达AS-tDR-007333可将PC9细胞阻滞在S期，而抑制AS-tDR-007333可降低S期细胞的比例(图3E-H)，A549细胞中也观察到类似的结果(图3I-L)。此外，过表达AS-tDR-007333组的迁移细胞数量明显高于对照组，而AStDR-007333抑制剂逆转了这些影响(图3M-Q)。

图3 AS-tDR-007333促进NSCLC细胞增殖和迁移能力

5. AS-tDR-007333通过上调MED29增强NSCLC细胞增殖

为了探究AS-tDR-007333调控的靶基因，将AS-tDR-007333转染到NSCLC细胞中。RNA-seq分析显示，AS-tDR-007333过表达细胞的转录组谱与NC细胞不同(图4A, B)。在差异表达基因中，AS-tDR-007333过表达上调最高的是MED29(图4C)。GO分析显示，差异表达基因在细胞组分的中介复合物(medium complex, MED)中显著富集(图4D)。此外，MED29在NSCLC肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织(图4E)。同样，qRT-PCR和Western blot分析证实，MED29基因和蛋白在NSCLC细胞中显著上调(图4F)。综上所述，这些结果提示AS-tDR-007333诱导的MED29上调可能在NSCLC的发病中起重要作用。

为了验证AS-tDR-007333与MED29在NSCLC中的关系，将AS-tDR-007333转染到NSCLC细胞中。Western blot和qRT-PCR分析显示，过表达AS-tDR-007333显著促进了MED29的表达，而抑制AS-tDR-007333则降低了MED29的表达水平(图4G)。此外，CCK-8检测显示，上调MED29促进A549和PC9细胞的增殖(图4H, I)，而下调MED29抑制NSCLC细胞的生长速度(图4J, K)。综上所述，这些结果提示AS-tDR-007333促进了MED29的表达，而MED29随后作为癌基因增强了NSCLC细胞的增殖。

图4 AS-tDR-007333通过上调MED29促进NSCLC细胞增殖

6. AS-tDR-007333与HSPB1相互作用，表观遗传学增强MED29的转录

为了阐明AS-tDR-007333在NSCLC中发挥生物学功能的机制，进行了RNA-pulldown实验，然后在NSCLC细胞中进行了质谱分析(图5A)。结果发现AS-tDR-007333与几种与癌症相关的RNA结合蛋白发生沉淀，包括HSPB1、DHX9、ACTB、YBX3和ILF2 (图5B)。其中，鉴于作者比较感兴趣的是HSPB1，因为HSPB1匹配分最高，并且有报道称HSPB1与NSCLC的发生进展有关。RIP实验证实AS-tDR-007333特异性结合内源性HSPB1(图5C)。计算蛋白质RNA对接分析也表明，HSPB1蛋白中的几个氨基酸残基对AS-tDR-007333结合至关重要(图5D)。这些数据提示AS-tDR-007333可能通过直接结合HSPB1在NSCLC细胞中发挥其生物学功能。

确定AS-tDR-007333是否通过与HSPB1相互作用调控NSCLC细胞增殖。首先检测了HSPB1在NSCLC细胞系和BEAS-2B细胞中的表达水平。qRT-PCR和Western blot结果一致显示，HSPB1在NSCLC细胞中的表达水平明显高于BEAS-2B细胞(图5E,F)。si-HSPB1和AS-tDR-007333共转染NSCLC细胞的挽救实验显示，si-HSPB1可显著降低过表达AS-tDR-007333增加的细胞增殖能力(图5G-J)，这表明AS-tDR-007333对NSCLC细胞增殖的影响是功能依赖的，至少部分依赖于HSPB1。

图5 AS-tDR-007333在NSCLC细胞中直接与HSPB1结合并相互作用

AS-tDR-007333可以与HSPB1互作，增强MED29的表达，因此推测AS-tDR-007333可能通过调控HSPB1来发挥其生物学功能，从而进一步修饰MED29的表达和功能。为了验证我们的假设，将AS-tDR-007333及其抑制剂转染到NSCLC细胞中，发现过表达AS-tDR-007333增加了HSPB1基因和蛋白的表达水平，而敲除AS-tDR-007333降低了HSPB1的表达(图6A-D)。敲除HSPB1不仅抑制了HSPB1的表达，还抑制了MED29的表达(图6E, G)。Co-IP实验表明，在NSCLC细胞中，HSPB1可以与MED29结合(图6F)，表明HSPB1和MED29之间存在潜在的相互作用。荧光素酶实验验证，AS-tDR-007333上调可显著提高MED29启动子活性，而AS-tDR-007333与si-HSPB1共转染可降低MED29启动子活性(图6H)。在功能上，将MED29和si-HSPB1共转染到NSCLC细胞中可以显著抑制MED29对细胞增殖的影响(图6I, J)。综上所述，AS-tDR-007333可能通过激活HSPB1-MED29的相互作用来增强NSCLC细胞的增殖。

组蛋白修饰在基因转录的表观遗传调控中起着重要作用。Western blot检测结果显示，与野生型细胞相比，si-HSPB1抑制H3K4me1和H3K27ac的表达水平(图6K)。此外，ChIP-qPCR检测表明，HSPB1敲除显著降低了MED29启动子区H3K4me1和H3K27ac的水平(图6L, M)。因此，这些数据表明AS-tDR-007333可能促进癌细胞增殖，至少部分是通过HSPB1介导的MED29启动子中的H3K4me1和H3K27ac修饰实现的.

图6 AS-tDR-007333激活HSPB1调控MED29启动子区H3K4me1和H3K27ac水平

7. AS-tDR-007333通过激活ELK4介导的转录调控上调MED29

由于HSPB1-MED29相互作用只能部分解释MED29的表达，并且已经有人提出转录因子(TF)可以靶向特定的MED亚基诱导转录反应，因此推断MED29的转录可能受到特定转录因子的影响。利用JASPAR和UCSC数据库分析，发现MED29启动子包含转录因子ELK4假定的结合位点(图7A)。为了评估ELK4对NSCLC的影响，将si-ELK4转染到NSCLC细胞中，发现si-ELK4显著抑制了NSCLC的增殖(图7B，C)。将AS-tDR-007333转染到NSCLC细胞中，发现AStDR-007333过表达显著促进了NSCLC细胞中ELK4的表达水平(图7D, E);相反，抑制AS-tDR-007333显著降低了ELK4的表达(图7D, F)。挽救实验进一步证实AS-tDR-007333在NSCLC细胞增殖中与si-ELK4相互作用(图7G，H)。 ChIP-PCR和荧光素酶报告基因实验证实ELK4直接结合到MED29基因的预测启动子区域(图7I, J)。总的来说，这些发现表明AS-tDR-007333与ELK4相互作用修饰MED29启动子转录。

图7 AS-tDR-00733通过ELK4介导的转录激活调控MED29

8. 靶向AS-tDR-007333在体内抑制NSCLC细胞生长

鉴于AS-tDR-007333在NSCLC中扮演着致癌肿瘤因子的角色，推测抑制AS-tDR-007333可能对NSCLC有治疗作用。为了评价AS-tDR-007333抑制剂的体内治疗效果(图8A)，合成AS-tDR-007333靶向抑制剂，并对其进行了优化，用于体内研究。如图8B、C所示，在整个实验期间，AS-tDR-007333抑制剂组的肿瘤体积明显小于NC组或空白对照组。AS-tDR-007333抑制剂组平均肿瘤重量显著高于对照组；与NC和对照组相比，AS-tDR-007333抑制剂组移植瘤组织中AS-tDR-007333、HSPB1、ELK4和MED29的表达水平显著降低(图8F-I)， AS-tDR-007333抑制剂同时抑制了移植瘤组织中MED29和Ki-67蛋白的表达水平(图8J)。因此，这些结果提示AS-tDR-007333抑制剂在体内可以通过抑制MED29的表达来抑制NSCLC肿瘤生长。

图8靶向AS-tDR-007333 inhibitor抑制了体内NSCLC肿瘤生长

结论：

该研究确定AS-tDR-007333为NSCLC中的一种新型致癌肿瘤因子。AS-tDR-007333通过激活HSPB1和ELK4介导的表观遗传和转录调控轴，靶向致癌MED29，促进NSCLC细胞的恶性肿瘤。此外，AS-tDR-007333抑制体外和体内NSCLC细胞增殖。该数据强调了tRF在NSCLC中的重要性，并表明AS-tDR-007333可以作为一种有前途的诊断/预后生物标志物和新的NSCLC治疗靶点(图9)。

图9 AS-tDR-007333如何通过HSPB1-MED29和ELK4-MED29轴促进NSCLC的发生

参考文献：

Yang W, Gao K, Qian Y, Huang Y, Xiang Q, Chen C, Chen Q, Wang Y, Fang F, He Q, Chen S, Xiong J, Chen Y, Xie N, Zheng D, Zhai R. A novel tRNA-derived fragment AS-tDR-007333 promotes the malignancy of NSCLC via the HSPB1/MED29 and ELK4/MED29 axes. J Hematol Oncol. 2022;15(1):53.