LncRNA-HGBC通过调节miR-502-3p/SET/AKT通路促进胆囊癌发展

LncRNA在很多癌症的发生和发展中起着重要作用，但在胆囊癌（GBC）中，很多新的LncRNA如何对疾病进行调节需进一步研究。本文中，作者通过芯片筛选出胆囊癌（GBC）患者中胆囊恶性肿瘤与周围良性组织微阵列中差异表达的LncRNA和mRNA，并阐明其对GBC细胞增殖、迁移、侵袭的作用机制。

本文技术路线如下：

主要结果如下:

1 、鉴定出LncRNA-HGBC，并发现LncRNA-HGBC表达水平与GBC预后相关

为找出胆囊恶性肿瘤与周围良性组织中差异表达的LncRNA和mRNA，通过芯片技术筛选出一些候选LncRNA，并发现其中的LncRNA-HGBC(LncRNA Highly expressed in GBC)在GBC肿瘤细胞中表达量显著高于周围良性组织，且LncRNA-HGBC高表达的患者总生存率（OS）显著低于LncRNA-HGBC低表达的患者（Fig 1A and B），揭示了LncRNA-HGBC在胆囊癌肿瘤细胞转移中起积极作用。随后，作者通过RACE快速扩增得到LncRNA-HGBC的5′端及3′端序列（Fig 1C），再通过PCR 扩增GBC全长序列，Northern杂交进一步证实在GBC细胞系中LncRNA HGBC的RNA全长约为2 kb（Fig 1D）。为确定LncRNA-HGBC所在位置，作者分离了NOZ细胞的细胞核和细胞质部分，进行了qRT-PCR检测，初步判断LncRNA-HGBC主要定位在细胞质中，与原位杂交(FISH)结果一致（Fig 1E）。通过体外翻译实验，发现LncRNA-HGBC并未参与任何蛋白质的表达（Fig 1F），表明LncRNA-HGBC是一个不编码蛋白质的长链RNA。

Figure 1 影响GBC进展的LncRNA的鉴定与表达分析

2、LncRNA-HGBC能在体内外促进GBC细胞增殖

为确定LncRNA-HGBC对GBC细胞增殖及对肿瘤发生的影响，研究中检测了LncRNA-HGBC在四种GBC细胞系（NOZ、GBC-SD、SGC-996、EH-GB1）中的表达情况，结果发现NOZ和SGC-996细胞系中LncRNA-HGBC的表达量高于GBC-SD和EH-GB1细胞系（Fig 2A）。在LncRNA-HGBC高表达的NOZ和SGC-996细胞系中通过干扰LncRNA-HGBC（Fig 2B），发现任意干扰两个区域都会使细胞增殖显著降低（Fig 2C），于此同时，干扰后菌落数量也显著减少，两种细胞系形成菌落的能力降低（Fig 2D）。此外，为了确定LncRNA-HGBC在体内对GBC细胞生长的影响，在小鼠中比较注射敲除了LncRNA HGBC的NOZ细胞和注射未经敲除的NOZ细胞时小鼠之间肿瘤差异，结果发现，前者较后者的肿瘤体积和肿瘤重量降低30%（Fig 2E）。通过免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA），观察细胞增殖情况，也得到了相同的结论，与对照组比较，LncRNA hGBC水平降低会引起细胞增殖水平下降（Fig 2F）。另一方面，在GBC-SD 和 EH-GB1细胞系中，通过建立LncRNA hGBC过表达的发现过表达细胞系中细胞的增殖速度明显提高（Fig 2G 、2H、2I），此外，过表达细胞系中肿瘤的体积和重量是对照组的2.5倍（Fig 2J），通过IHC染色发现过表达细胞系异种移植瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）上调（Fig 2K）。

Figure 2  LncRNA-HGBC促进GBC细胞增殖和肿瘤生长

3、LncRNA -HGBC促进GBC细胞进行上皮细胞-间充质转化（EMT）和肿瘤转移

为了判断LncRNA –HGBC表达水平与淋巴结细胞迁移之间的关系，研究中首先提出了LncRNA –HGBC促进GBC细胞迁移的假设，并进行验证。通过transwell和基质胶侵袭实验，发现在NOZ 和 SGC-996 细胞系中，敲除LncRNA -HGBC可显著减少约30-40%的细胞迁移和侵袭（Fig 3A，3B）。反之，在GBC-SD 和 EH-GB1细胞系中细胞，对LncRNA- HGBC进行过表达，发现在GBC细胞迁移和侵袭能力增加20-50%（Fig 3C，3D）。EMT（上皮细胞-间充质转化）在很多肿瘤细胞迁移和侵袭中非常重要，为了评估EMT是否参与GBC侵袭，本研究中检测了两种EMT特异性标记物，分别是波形蛋白和N-钙粘蛋白。作者在NOZ 和SGC-996 cells细胞系中，敲除LncRNA –HGBC发现波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达量降低（Fig 3E），反之，在GBC-SD 和 EH-GB1细胞系中，对LncRNA- HGBC进行过表达，发现波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达量升高（Fig 3F），说明LncRNA- HGBC可能引起EMT的发生。为进一步验证，作者将NOZ细胞注射到小鼠脾脏中建立了裸鼠肝转移瘤模型，对照组的6只小鼠中有5只（5/6）在移植6周后显示荧光素酶信号增强，并在肝内发生转移，而注射 干扰LncRNA-HGBC后只小鼠中只有3只小鼠出现肝内转移。在肝脏中，对 LncRNA-HGBC 进行干扰的小鼠中转移灶较对照组降低10%（Fig 3G，3H)。

Figure 3  LncRNA-HGBC增强GBC细胞的侵袭能力

4、 HuR与LncRNA-HGBC特异结合并维持LncRNA-HGBC稳定表达

为探索LncRNA-HGBC与是否与GBC细胞存在潜在蛋白，通过pull-down实验，发现LncRNA-HGBC在37kd处存在与蛋白质的互作（Fig 4A），进一步通过 Western免疫印迹证实与LncRNA-HGBC结合的蛋白为HuR（Fig 4B），通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）验证LncRNA-HGBC与HuR的互作，与富含HuR结合位点的阳性对照EIF4E mRNA相比，通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验证验了LncRNA HGBC和HuR之间的特异性相互作用（Fig 4C）。为了进一步确定LncRNA HGBC中的哪个特定区域与HuR结合有关，作者构建了4个不同的LncRNA -HGBC缺失片段（Fig 4D），通过pull-down实验之后再进行Western免疫印迹确定了LncRNA -HGBC的1759–1906nt区域与HuR特异结合（Fig 4E）。为了阐明HuR是否影响LncRNA-HGBC在GBC细胞中的稳定性，通过两次HuR敲除实验均发现LncRNA-HGBC在NOZ细胞系中的表达量降低（Fig 4F）；为进一步探索 LncRNA-HGBC表达量的降低是不是由于 LncRNA-HGBC衰退所致，通过阻断RNA的转录，观察30h内 LncRNA-HGBC表达量的变化，结果发现，随着HuR的逐步消耗，LncRNA-HGBC水平的半衰期从18小时降低到5小时（Fig 4G），这一系列实验表明HuR与LncRNA HGBC相互作用并维持LncRNA HGBC稳定表达。

Figure 4 HuR与LncRNA-HGBC特异结合并有助于维持LncRNA-HGBC稳定表达

5、 LncRNA-HGBC作为一种竞争性内源性RNA抑制miR-502-3p表达

前期的研究已经证实LncRNA-HGBC定位在细胞质上，作者初步假设LncRNA -HGBC可能作为miRNA海绵影响miRNA的表达，在GBC的进展中发挥作用。为了找出与LncRNA-miRNA相互作用的miRNA， 作者将LncRNA-HGBC全长序列克隆到pmirGLO双荧光素酶报告载体中，将6个与肿瘤抑制相关的候选miRNA通过双荧光素酶实验进行分析，发现其中的miR-502-3p和miR-618可抑制LncRNA-HGBC的荧光素酶活性(Fig 5A)，说明LncRNA-HGBC可能与miR-502-3p、miR-618相互作用。作者根据先前的miRNA微阵列结果发现，与邻近的非肿瘤组织相比，在GBC组织中miR-502-3p表达量确实下调了。当LncRNA-HGBC中1176 - 1183nt之间的序列被敲除后将不能与miR-502-3p结合，荧光活性将不会再被抑制(Fig 5B)。AGO2蛋白可以在转录后调控调节miRNA丰度，内源性Ago2的减少会降低成熟miRNA的表达和活性。进一步进行免疫共沉淀实验，发现AGO2抗体复合物在LncRNA-HGBC和miR-502-3p中特异富集，表明miR-502-3p是一个真正的靶向LncRNA-HGBC的miRNA(Fig 5C)。为进一步确定LncRNA-HGBC是否与miR-502-3p结合，作者通过MS2-RIP找到与LncRNA-HGBC结合的 miRNA，结果再一次证实了miR-502-3p与LncRNA-HGBC特异性结合(Fig 5D)，而且miR-502-3p结合位点的突变也使miR-502-3p与LncRNA-HGBC之间的结合不再成立，也验证了LncRNA-HGBC和miR-502-3p之间的直接结合。为了进一步阐明LncRNA-HGBC和miR-502-3p之间基因表达的调控关系，评估了不同lncRNA-HGBC表达水平对细胞中的miR-502-3p水平的影响。结果发现，在 NOZ细胞系中，敲低LncRNA-HGBC 会导致miR-502-3p表达量上调了60%(Fig 5E左图)，在EH-GB1细胞系中，LncRNA-HGBC过表达后miR-502-3p的表达被抑制，表达量下降了50%(Fig 5E右图)， 但对miR-502-3p进行敲除或过表达时LncRNA-HGBC的表达量没有变化，说明LncRNA-HGBC作为海绵会抑制miR-502-3p表达，但不能诱导其降解。为了检测LncRNA HGBC的活性是否取决于其与miR-502-3p的结合，在异位表达野生型LncRNA HGBC和结合突变型HGBC-MUT后进行cck-8和Transwell分析，结果发现，LncRNA-HGBC（而非HGBC-MT）的表达可显著促进细胞迁移、侵袭和增殖(Fig 5F-G)，由此可见，LncRNA-HGBC与miR-502-3p能结合，并可作miR-502-3p的海绵抑制其表达。

Figure 5 LncRNA-HGBC作为一种竞争性内源性RNA能直接与miR-502-3p结合

6、LncRNA-HGBC通过竞争性结合miR-502-3p调节SET的表达

miR-502-3p可以靶向多种蛋白质，并在癌症发展过程中发挥重要，作者通过芯片数据分析发现SET在GBC组织中也上调，那么miR-502-3p是否对SET进行调节需进一步探索。作者将含有SET 3′UTR的荧光素酶报告载体转染到293T细胞中，然后在转染miR-502-3p模拟物时评估荧光素酶活性，发现miR-502-3p显著降低了SET报告载体的荧光素酶活性此外，在GBC细胞系中，对miR-502-3p进行过表达或敲除之后，SET随之变化，说明SET是miR-502-3p的直接靶点。

由于LncRNA-HGBC和SET 3′UTR都与miR-502-3p结合，于是进一步研究LncRNA HGBC是否调节了GBC细胞中miR-502-3p，并对SET进行抑制。将pmirGLO-SET荧光素酶报告载体与LncRNA-HGBC过表达质粒进行共转染，过表达miR-502-3p将会抑制SET报告载体的荧光素酶活性，但过表达cRNA-HGBC将会诱导SET报告载体的荧光素酶活性（Fig 6A)。当miR-502-3p和LncRNA-HGBC同时被添加时，荧光活性恢复到对照水平，这就意味着LncRNA- HGBC能够通过与miR-502-3p结合，进而上调SET。进一步研究SET 如何控制蛋白表达，在内源性LncRNA HGBC 高表达的 NOZ细胞系中进行LncRNA-HGBC干扰和miR-502-3p抑制，结果发现LncRNA-HGBC的敲除抑制了SET的表达，miR-502-3p抑制剂的加入反而促进了SET的表达（Fig 6B，左图)。然而，在内源性LncRNA HGBC 低表达的EH-GB1细胞系中，过表达LncRNA-HGBC诱导SET表达，此时加入miR-502-3p，SET表达量将会降低至对照水平（6B，右图)。在NOZ细胞细胞系中，对LncRNA HGBC进行干扰将会抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，而miR-502-3p的加入逆转了这种局势（Fig 6CandD) 。

然而，在EHGB1细胞系中，过表达miR-502-3p延缓了细胞的生长、迁移和侵袭(Fig 6C and E)。为检测LncRNA HGBC是否诱导SET表达是否取决于LncRNA HGBC与miR-502-3p的结合，在GBC-SD和EH-GB1两个细胞系中，通过过表达LncRNA-HGBC发现mRNA和蛋白质水平上SET表达上调，LncRNA HGBC的过度表达导致SET表达增加，而LncRNA HGBC的miR-502-3p结合位点突变却未能诱导SET表达(Fig 6FandG)，通过IHC发现，肿瘤异种移植模型中在LncRNA-HGBC耗尽之后SET的表达量也随之降低，过表达LncRNA-HGBC的肿瘤异种移植模型中LncRNA-HGBC表达量显著增加，说明LncRNA-HGBC和SET之间存在共表达，LncRNA-HGBC通过竞争性结合miR-502-3p调节SET的表达。
 

Figure 6  LncRNA-HGBC通过竞争性结合miR-502-3p调节SET的表达

7、AKT是SET的下游效应物、lncRNA与miR-502-3p、SET和p-AKT的关系

接下来对LncRNA-HGBC和SET对影响GBC转移的分子机制进行研究。研究发现对SET进行敲除后GBC细胞的增殖和侵袭能力明显降低，已有研究表明SET在很多癌症中是通过激活AKT提高癌细胞活性，那么LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT是否作为一个完整的信号通路介导GBC发生和转移的需要进一步验证。

作者首先检测了AKT激酶的活性，在NOZ和SGC-996细胞系中，通过WB实验发现了敲除LncRNA -HGBC显著抑制了AKT的活性（Fig 7A）；在GBC-SD和EH-GB1细胞系中，过表达LncRNA-HGBC能诱导 AKT的磷酸化，起到信号传导的作用（Fig 7B）。

为确定LncRNA-HGBC对AKT的诱导是否通过调控miR-502-3p实现的，在GSC-SD和EH-GB1细胞系中，作者通过突变LncRNA-HGBC上与 miR-502-3p结合的位点，发现过表达LncRNA-HGBC能诱导 AKT的磷酸化，以及N-钙粘蛋白、波形蛋白的表达，进行突变的LncRNA-HGBC不能再对蛋白进行诱导（Fig 7C）。在EH-GB1细胞系中，将miR-502-3p导入过表达LncRNA-HGBC中会降低了这些蛋白的表达（Fig 7D）；MK2206作为AKT抑制剂能逆转LncRNA-HGBC对N-钙粘蛋白和波形蛋白表达的影响（Fig 7E），表明LncRNA HGBC需要AKT激活。

 为了进一步分析LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT之间的关联，作者在43对GBC组织中进行分析，发现LncRNA HGBC与miR-502-3p呈负相关，与SET和HuR mRNA水平呈正相关（Fig 7F），与非肿瘤组织相比，HuR在GBC组织中表达上调，通过IHC分析发现，与非肿瘤组织相比，SET或p-AKT在GBC组织中表达上调（Fig 7G），此外，LncRNA -HGBC表达与SET和p-AKT表达呈正相关(Fig 7H and G)。综上所述，LncRNA HGBC能通过竞争性结合miR-502-3p发挥作用，然后激活下游SET和AKT表达，从而加强肿瘤细胞的侵略性。

Figure 7  AKT是SET的下游效应物、lncRNA与miR-502-3p、SET和p-AKT的关系

本文发现了一个与GBC预后差相关的LncRNA-HGBC，并阐明了LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT通路介导GBC增殖、迁移、侵袭的分子机制。

参考文献：

Hu Y P , Jin Y P , Wu X S , et al. LncRNA-HGBC stabilized by HuR promotes gallbladder cancer progression by regulating miR-502-3p/SET/AKT axis[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1). DOI：10.1186/s12943-019-1097-9.