热点大碰撞：缺氧肿瘤干细胞-外泌体-lncRNA
栏目：最新研究动态
发布时间：2021-03-02
导语：胶质瘤干细胞（GSC）是胶质瘤中具有特殊增殖和分化能力的肿瘤细胞亚群，是肿瘤复发的主要原因之一，尤其在低氧条件下。外泌体是......
导语：胶质瘤干细胞（GSC）是胶质瘤中具有特殊增殖和分化能力的肿瘤细胞亚群，是肿瘤复发的主要原因之一，尤其在低氧条件下。外泌体是一种脂质膜囊泡，含有蛋白质和遗传物质，介导细胞间通讯。长链非编码RNA（lncRNA）参与众多生物学过程，但其在肿瘤发生、发展中的作用仍知之甚少。缺氧GSC、外泌体及lncRNA这些热点碰撞出怎样的火花，我们先睹为快。
参考文献：Li, J., et al., Hypoxic glioma stem cell-derived exosomes containing Linc01060 promote progression of glioma by regulating the MZF1/c-Myc/HIF-1α. Cancer research, 2020. (IF=9.727)
参考文献：Li, J., et al., Hypoxic glioma stem cell-derived exosomes containing Linc01060 promote progression of glioma by regulating the MZF1/c-Myc/HIF-1α. Cancer research, 2020. (IF=9.727)
技术路线：
结果：
1. GSCs分泌的Linc01060转移到胶质瘤细胞
从人胶质母细胞瘤GBM手术标本中分离原代肿瘤细胞和胶质瘤干细胞，流式细胞术和球体形成实验进行鉴定。在正常或缺氧条件下培养GSCs，分别形成常氧(N-GSCs)和缺氧(H-GSCs)细胞。GBM、N-GSCs和H-GSCs的条件培养基处理胶质瘤U-87细胞时，发现GSCs的培养基显著促进细胞增殖、迁移和侵袭，尤其是H-GSCs。
为鉴定GSCs中潜在的外泌体相关lncRNA，使用有或无缺氧的GSCs外泌体和相应的GBM原代细胞进行lncRNA测序。鉴定出Linc01060是聚类中评分最高的非编码RNA之一。从GSCs的培养基中提取外泌体，透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)和蛋白质印迹法(WB)鉴定其形态、大小和表面标记物。观察到缺氧促进了外泌体的释放。
单独用RNase A处理GSCs时，条件培养基中Linc01060水平没变化；但用RNase A和Triton X-100联合处理时，其水平显著降低。同时，外泌体中Linc01060的水平与条件培养基中相似。说明外泌体是细胞外Linc01060的主要载体。Linc01060在6种胶质瘤细胞系中明显上调，GSCs中Linc01060的过表达或敲低分别导致外泌体Linc01060的上调或下调。FISH分析证明Linc01060主要位于细胞质，免疫荧光(IF)结果显示细胞有效地吸收外泌体。这些结果表明GSC分泌的Linc01060可通过外泌体转移到胶质瘤细胞。
为鉴定GSCs中潜在的外泌体相关lncRNA，使用有或无缺氧的GSCs外泌体和相应的GBM原代细胞进行lncRNA测序。鉴定出Linc01060是聚类中评分最高的非编码RNA之一。从GSCs的培养基中提取外泌体，透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)和蛋白质印迹法(WB)鉴定其形态、大小和表面标记物。观察到缺氧促进了外泌体的释放。
单独用RNase A处理GSCs时，条件培养基中Linc01060水平没变化；但用RNase A和Triton X-100联合处理时，其水平显著降低。同时，外泌体中Linc01060的水平与条件培养基中相似。说明外泌体是细胞外Linc01060的主要载体。Linc01060在6种胶质瘤细胞系中明显上调，GSCs中Linc01060的过表达或敲低分别导致外泌体Linc01060的上调或下调。FISH分析证明Linc01060主要位于细胞质，免疫荧光(IF)结果显示细胞有效地吸收外泌体。这些结果表明GSC分泌的Linc01060可通过外泌体转移到胶质瘤细胞。
2. GSC来源的外泌体Linc01060促进胶质瘤的进展
为阐明外泌体介导的Linc01060的生物学功能，EdU细胞增殖实验、克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验以及动物实验验证GSC来源的外泌体可以加速肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，敲低Linc01060，外泌体不促进这些过程。
3. Linc01060结合并稳定MZF1蛋白
细胞质lncRNA在翻译或翻译后过程中发挥调控作用。利用RNA pull-down和质谱分析筛选Linc01060相互作用蛋白，重点研究RNA结合转录因子髓样锌指1(MZF1)。RIP、pull-down试验证明MZF1与Linc01060的特异性结合。为验证Linc01060内与MZF1结合的特定区域，创建了Linc01060的四个截断片段，发现MZF1特异性结合序列位于Linc01060基因的281-481nt长区域。
观察到Linc01060水平的改变调节了MZF1蛋白水平，在Linc01060敲除或过表达的细胞中，MZF1 mRNA水平没有显著差异。因此，推测Linc01060可能稳定MZF1蛋白。蛋白酶体抑制剂MG-132可挽救Linc01060下调导致MZF1蛋白水平下降的现象，cycloheximi追踪试验显示，MZF1在Linc01060下调的细胞中具有较短的半衰期；在过表达Linc01060的细胞中具有较长的半衰期。这表明Linc01060可能通过抑制其蛋白酶体介导的降解来调节MZF1。用体外泛素化实验探索Linc01060是否与泛素介导的MZF1降解有关。Linc01060的敲低增强了U-87 细胞和U-251细胞中MZF1蛋白的泛素化。相反，在Linc01060过表达的细胞中，泛素介导的MZF1降解明显减少。这些结果表明Linc01060稳定了MZF1蛋白，并保护其免受泛素介导的蛋白酶体降解。
观察到Linc01060水平的改变调节了MZF1蛋白水平，在Linc01060敲除或过表达的细胞中，MZF1 mRNA水平没有显著差异。因此，推测Linc01060可能稳定MZF1蛋白。蛋白酶体抑制剂MG-132可挽救Linc01060下调导致MZF1蛋白水平下降的现象，cycloheximi追踪试验显示，MZF1在Linc01060下调的细胞中具有较短的半衰期；在过表达Linc01060的细胞中具有较长的半衰期。这表明Linc01060可能通过抑制其蛋白酶体介导的降解来调节MZF1。用体外泛素化实验探索Linc01060是否与泛素介导的MZF1降解有关。Linc01060的敲低增强了U-87 细胞和U-251细胞中MZF1蛋白的泛素化。相反，在Linc01060过表达的细胞中，泛素介导的MZF1降解明显减少。这些结果表明Linc01060稳定了MZF1蛋白，并保护其免受泛素介导的蛋白酶体降解。
4. Linc01060加速MZF1的核转位，促进MZF1介导的c-Myc反式激活
免疫荧光发现Linc01060可调节MZF1的总水平和核水平。MZF1主要定位于细胞质，少量存在于细胞核中。在Linc01060敲低细胞中，MZF1在细胞核中几乎检测不到，在Linc01060过表达的细胞中，细胞核中的MZF1水平显著增加。
作为一种双功能转录因子，MZF1通过与启动子结合抑制或激活基因转录。MZF1与癌症有，它转位到细胞核并激活c-Myc，从而具有致癌作用，推测Linc01060在MZF1/c-Myc信号轴中起作用。免疫共沉淀实验发现敲低Linc01060大大削弱了MZF1和c-Myc之间的相互作用。接下来探索Linc01060是否可以调节MZF1介导的c-Myc转录活性。荧光素酶报告基因检测表明，单独过表达MZF1及其与Linc01060的表达可增强转录活性。相关拯救实验表明，Linc01060和MZF1的耗竭均可导致c-Myc转录活性显著下降。检测参与Warburg效应的MZF1和c-Myc靶基因的表达，如HK、PGK1、LDHA、GLUT1和ENO1；发现Linc01060和MZF1共转染导致这些基因高表达；而敲低导致其低表达。表明Linc01060增强了MZF1介导的c-Myc转录活性。
作为一种双功能转录因子，MZF1通过与启动子结合抑制或激活基因转录。MZF1与癌症有，它转位到细胞核并激活c-Myc，从而具有致癌作用，推测Linc01060在MZF1/c-Myc信号轴中起作用。免疫共沉淀实验发现敲低Linc01060大大削弱了MZF1和c-Myc之间的相互作用。接下来探索Linc01060是否可以调节MZF1介导的c-Myc转录活性。荧光素酶报告基因检测表明，单独过表达MZF1及其与Linc01060的表达可增强转录活性。相关拯救实验表明，Linc01060和MZF1的耗竭均可导致c-Myc转录活性显著下降。检测参与Warburg效应的MZF1和c-Myc靶基因的表达，如HK、PGK1、LDHA、GLUT1和ENO1；发现Linc01060和MZF1共转染导致这些基因高表达；而敲低导致其低表达。表明Linc01060增强了MZF1介导的c-Myc转录活性。
5. Linc01060由缺氧诱导，HIF-1α反式激活
研究引起胶质瘤中Linc01060高表达的因素。c-Myc在转录后水平可增强HIF-1α的积累，保护其免受泛素介导的蛋白酶体降解。对Linc01060基因组序列上游~2 kb区域进行JASPAR和UCSC分析，发现启动子区有一个预测的HIF-1α结合位点。缺氧或CoCl2预处理1天，Linc01060和HIF-1α水平明显升高。在常氧和低氧条件下敲低HIF-1α基因可显著抑制Linc01060的转录。ChIP–qPCR、荧光素酶结果证明HIF-1α直接结合到Linc01060基因启动子区的相同染色质片段。这些证明Linc01060是HIF-1α的直接转录靶点。
6. Linc01060通过促进有氧糖酵解促进胶质瘤进展
生物信息学预测Linc01060可能参与肿瘤细胞的糖酵解代谢。耗氧量率(OCR)实验检测Linc01060在有氧糖酵解中的作用，发现沉默Linc01060增加了最大呼吸，而细胞外酸化率(ECAR)曲线表明敲低Linc01060显著降低了U-87细胞中的糖酵解、糖酵解储备和糖酵解能力，表明Linc01060促进糖酵解代谢。当Linc01060下调时，U-87细胞中18F-FDG摄取、乳酸生成和细胞ATP水平显著降低。所有这些表明Linc01060可以调节胶质瘤的糖酵解代谢。
7. Linc01060通过调节MZF1/c-Myc/HIF-1α轴促进胶质瘤进展
将MZF1、c-Myc或HIF-1α质粒转染到下调Linc01060的U-87 细胞中，显著恢复对细胞增殖、葡萄糖摄取、乳酸生成和细胞ATP水平的抑制。证明Linc01060依赖于MZF1/c-Myc/HIF-1α信号轴调节细胞增殖和有氧糖酵解。
血清外泌体Linc01060与肿瘤进展有关为研究血清或脑脊液中外泌体Linc01060水平升高是否与胶质瘤发生有关。从胶质瘤患者和健康人群的血清和CSF中分离出外泌体，发现肿瘤患者循环外泌体中Linc01060水平较高，尤其是高级别胶质瘤组织。肿瘤组织显示Linc01060/MZF1/c-Myc/HIF-1α的高表达，尤其是在HGG中。此外，来自血清和CSF的循环外泌体中Linc01060表达水平与胶质瘤组织中的表达水平呈正相关。这表明胶质瘤组织中Linc01060的上调可导致循环外泌体中Linc01060水平升高。临床数据强烈提示循环外泌体中高水平的Linc01060与胶质瘤进展有关。单变量和多变量回归分析显示Linc01060水平是胶质瘤患者的独立预后指标，风险比显著。以上表明Linc01060可能是胶质瘤的潜在生物标志物。
血清外泌体Linc01060与肿瘤进展有关为研究血清或脑脊液中外泌体Linc01060水平升高是否与胶质瘤发生有关。从胶质瘤患者和健康人群的血清和CSF中分离出外泌体，发现肿瘤患者循环外泌体中Linc01060水平较高，尤其是高级别胶质瘤组织。肿瘤组织显示Linc01060/MZF1/c-Myc/HIF-1α的高表达，尤其是在HGG中。此外，来自血清和CSF的循环外泌体中Linc01060表达水平与胶质瘤组织中的表达水平呈正相关。这表明胶质瘤组织中Linc01060的上调可导致循环外泌体中Linc01060水平升高。临床数据强烈提示循环外泌体中高水平的Linc01060与胶质瘤进展有关。单变量和多变量回归分析显示Linc01060水平是胶质瘤患者的独立预后指标，风险比显著。以上表明Linc01060可能是胶质瘤的潜在生物标志物。
