高分文章的奥秘:piRNA联合m6A甲基化

栏目:最新研究动态 发布时间:2021-02-23
导语:弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) 淋巴系统恶性肿瘤中最常见的亚型,其发生和进展受遗传和表观遗传畸变控制。作为真核信使RNA最丰富......

导语:弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) 淋巴系统恶性肿瘤中最常见的亚型,其发生和进展受遗传和表观遗传畸变控制。作为真核信使RNA最丰富的化学修饰,N6-甲基腺苷(m6A)通过调节靶基因表达影响各种基本的生物过程。PIWI相互作用RNA(piRNA)是一类非编码RNApiRNA可通过调控DNA甲基化引导PIWI蛋白沉默转座因子。piRNAm6A甲基化联合起来,一篇高分文章新鲜出炉。

(IF=17.543)

技术路线

结果
1. piRNA-30473DLBCL中升高,是DLBCL患者的不良预后因素
首先微阵列分析检测石蜡包埋DLBCL组织中小RNA的表达水平,鉴定出4个显著失调表达的piRNA。取来自42例其他DLBCL患者组织,进一步证实4piRNADLBCL患者中的表达。发现,预后不良患者的piRNA-30473表达水平显著升高。卡普兰-梅尔分析显示DLBCL患者中高piRNA-30473水平与较差的生存相关piRNA-30473可作为预后的生物标志物。

2. piRNA-30473的抑制降低了DLBCL的增殖和肿瘤发生
进一步探索piRNA-30473DLBCL中的功能作用,在人DLBCL细胞中使用antagomir-30473敲除piRNA-30473,发现与对照组相比,DLBCL细胞中piRNA-30473的缺失导致细胞增殖减少(图2AS1B)。细胞周期分析显示,抑制DLBCL细胞中的piRNA-30473可增强G1期细胞,减少S期和G2期细胞(图2B2 CS1 CS1D)。然而,piRNA-30473的缺失并不能诱导细胞凋亡(图2DS1E)。

此外,构建SU-DHL-8异种移植DLBCL模型,以评估piRNA-30473对体内DLBCL进展的影响(图2E)。与对照组相比,antagomir-30473给药导致肿瘤体积显著减小(图2F)。
这些表明,沉默piRNA-30473在体内外抑制细胞活性

3. piRNA-30473通过调节WTAP的表达介导m6A甲基化
进一步探索piRNA-30473DLBCL表观转录调控中的作用,在antagomir-30473转染后检测整体m6A甲基化水平,发现antagomir-30473转染细胞中的整体m6A水平降低,沉默piRNA-30473可降低RNA甲基转移酶WTAP的表达。antagomir-30473处理部分降低了DLBCL异种移植模型中的WTAP表达。

研究表明,WTAP介导METTL3METTL14募集到mRNA靶标。免疫共沉淀发现antagomir-30743处理降低了WTAPMETTL3METTL14的关联。通过miRNA特异性靶标检测算法miRanda,发现piRNA-30473WTAP3’UTR内有一个结合位点。双荧光素酶报告基因检测进一步验证WTAPpiRNA-30473的定向靶基因,敲除piRNA-30473导致WTAP mRNA的稳定性下降。基于这些观察结果,得出结论,piRNA-30473通过与WTAP3’UTR结合,减少WTAP mRNA衰变,然后增强mRNA稳定性。

4. WTAPDLBCL中起致癌作用
接下来研究WTAPDLBCL的临床效应,免疫组织化学评估发现WTAP在预后不良的患者中高表达, GEO数据库发现WTAP的高表达预示着预后不良。

深入了解WTAP调控DLBCL发展和预后的机制,发现弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中敲低WTAP产生的效应和piRNA-30473敲低相似,整体m6A水平降低,生长抑制和细胞周期停滞,细胞凋亡无变化。在下调piRNA-30473的细胞中恢复WTAP的表达,在很大程度上逆转已改变的生物活性。以上数据表明WTAPpiRNA-30473功能上重要的靶点,并在DLBCL中发挥致癌作用。

5. RNA-seqm6A-seq鉴定WTAP靶标
为进一步验证WTAP介导的m6A甲基化对DLBCL细胞的影响,对对照组和WTAP敲除的SU-DHL-8细胞进行m6A-seq。与已发表研究一致,发现共有基序DRACH富集在免疫纯化的RNA中。m6A-seq在对照和WTAP缺陷细胞中鉴定出172741900m6A峰,m6A位点主要在外显子和3’UTRs中发现, m6A残基最高富集于终止密码子附近。

RNA-seq发现186个转录本显著下调,而318个转录本显著上调。由于WTAP是一种m6A甲基转移酶,WTAP敲除后携带低甲基化m6A峰的转录本可能是WTAP的靶标。过滤差异表达基因中发生的低甲基化m6A峰,鉴定出136个基因;检测了DLBCL患者样本中WTAP与上述基因的相关性,发现28个基因的表达与DLBCL中的WTAP相关。在所有数据集中,只有HK2WTAP显著相关。编码己糖激酶2HK2有助于肿瘤的高糖酵解率,DLBCL低氧应激时促进生长需要HK2,提示HK2DLBCLWTAP的关键靶基因。m6A-seq数据表明WTAP靶向HK2转录本的5’UTRWTAP敲低引起HK2 5’UTRm6A水平显著下降。
敲低WTAP后,细胞的m6A水平显著下调;发现WTAP敲除显著降低了pGL3-HK2-WT野生型载体的荧光素酶活性(pGL3-HK2-WT载体具有完整的m6A位点),而m6A位点的突变则消除这种抑制。用CRISPR/Cas9敲除HK2 5’UTR上的WTAP结合位点,发现HK2m6A RNA甲基化位点的缺失逆转了WTAP介导的表型变化,证实WTAP/HK2轴在DLBCL中的机制作用。
使上述结果表明HK2DLBCLWTAP的直接下游靶点。

6. m6A RNA阅读器IGF2BP2对于HK2的转录后调节至关重要
IGF2BPs是成熟的m6A阅读器,可识别哺乳动物细胞中数千个甲基化转录本。m6A-seq结果发现IGF2BP结合位点位于HK25’UTR

IGF2BP2缺陷细胞中HK2的转录水平显著降低,稳定性往往较差。荧光素酶报告基因实验进一步证实IGF2BP2靶向HK2 mRNA5’UTR
综上所述得出结论,RNA结合蛋白IGF2BP2WTAP共同发挥作用,影响DLBCL细胞中HK2 mRNA的稳定性和表达。

总结:1. m6A修饰机制在DLBCL中至关重要;
           2. piRNA-30473通过WTAP/HK2轴调控m6A甲基化,进而调控肿瘤发生和疾病进展。