与蛋白相互作用的lncRNA又撬动了肿瘤转移的杠杆

    LINC00941是一种新的lncRNA，已被发现在肿瘤发生过程中表现出起源性和促转移性行为。然而，其在转移性CRC中的作用仍不清楚。本文旨在研究LINC00941在CRC转移中的作用及其机制，并于2020年7月31日发表在《Cell Death & Differentiation》IF: 10.717杂志上。
技术路线：

结果：
1、CRC中LINC00941表达上调与预后不良相关
    作者首先通过组织芯片ISH染色发现LINC00941主要定位与染色质中，并且在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且高表达的病人预后较差。然后TCGA数据库分析得出了一样的结论，不仅如此，ISH染色进一步发现在转移结节中其表达量更高，在转移性CRC细胞系的表达也都显著高于其它细胞系。总之，CRC中LINC00941表达上调与预后不良相关。

图1 CRC中LINC00941表达上调与预后不良相关

2、LINC00941促进CRC细胞迁移和侵袭能力，激活EMT
    体外功能实验结果与预期一致，敲除LINC00941后CRC细胞的迁移和侵袭表型显著抑制。类似的，敲除敲除LINC00941后CRC细胞的EMT分子标志物的表达显著下降，过表达则相反。这些说明LINC00941促进CRC细胞迁移和侵袭能力，激活EMT。

图2 LINC00941促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力

3、LINC00941通过抑制SMAD4的泛素化增强了其蛋白稳定性
    鉴于lncRNA通常通过RNA-蛋白质相互作用的方式影响基因的表达，因此，作者检测了能与LINC00941相互作用的蛋白以获得LINC00941诱导EMT的深层次的分子机制。RNA pulldown及质谱实验检测到SMAD4蛋白在LoVo-Sh- LINC00941细胞中下调，在HCT-116-LINC00941中上调，因而引起了作者的注意。随后WB和RIP实验证实LINC00941和SMAD4存在相互作用。之后，通过截短实验，发现LINC00941的1465-1895区间可以与SMAD4结合，而SMAD4的MH2区域和全长可以与LINC00941结合，表明LINC00941与SMAD4存在结合作用。细胞质lncRNA通常通过准路后调控修饰蛋白。CHX实验结果显示LINC00941增强了SMAD4蛋白的稳定性通过延长其降解半衰期。为了明确LINC00941诱导SMAD4降解的深层机制，使用蛋白酶体抑制剂(MG132)处理LoVo-Sh-LINC00941细胞。通过WB分析发现MG132可显著恢复LoVo-Sh-LINC00941细胞中SMAD4蛋白水平，这表明LINC00941诱导的SMAD4蛋白降解是由泛素-蛋白酶体途径介导的。总之，上述结果表明CRC细胞中LINC00941可以通过抑制SMAD4的泛素化稳定其表达。

图3 LINC00941促进SMAD4蛋白的稳定性

4、LINC00941通过与β-TrCP竞争抑制SMAD4泛素化
    文献报道，SMAD4可以被β-TrCP多聚泛素化并降解，因此作者研究了β-TrCP在CRC细胞中SMAD4泛素化和降解的功能重要性。结果表明抑制β-TrCP的表达可以增加SMAD4的表达，并减少LoVo和HCT-116细胞中的SMAD4的泛素化水平。进一步的，研究发现LINC00941的缺失显著增加了SMAD4和β-TrCP的结合，相反，过表达LINC00941则显著抑制了SMAD4与β-TrCP的结合。不仅如此，作者发现SMAD4的MH2区域和全长可以与β-TrCP结合，这暗示着β-TrCP控制了SMAD4的泛素化和降解通过MH2区域和全长。因此，作者猜测LINC00941与β-TrCP可能存在竞争性结合SMAD4的关系，而这一猜测通过竞争性RNA pulldown实验得到证实。总之，这些结果表明LINC00941通过与β-TrCP竞争性结合SMAD4抑制其降解从而增强了其稳定性。

图4 LINC00941通过阻断SMAD4与βTrCP的结合抑制了SMAD4的泛素化

5、在转移性CRC中，LINC00941被TGF- cad1上调，并与SMAD2/3信号通路的激活相关
    TGF-β1/SMAD信号通路是EMT的关键调节因子，SMAD4是重要的辅因子，可与活化的SMAD2和SMAD3结合形成调节目标基因转录的寡聚复合物。因此作者就评估了LINC00941在TGF-β1/ SMAD信号通路中的作用。结果显示在LINC00941沉默的细胞中使用TGF-β1处理后LINC00941的表达，细胞的迁移和侵袭都显著提高了，而使用TGF-β1抑制剂处理则效果相反。类似的，EMT标志物的表达水平也有一致的变化趋势，这些结果提示TGF-β1参与了LINC00941诱导的EMT进程。重要的是，荧光素酶报告基因检测显示，TGF-β1处理后，报告基因的荧光素酶活性显著增加。此外，使用TGF-β1处理的LoVo-Sh- LINC00941细胞处理的裸鼠具有的更多的转移结节，并且预后更差。这些结果证实TGF-β1和LINC00941之间存在强烈的相互作用关系。

图5在linc00941诱导的转移促进中，TGF-β高表达是必要的

    总之，本文发现LINC00941通过抑制SMAD4蛋白降解，激活TGF-β/ SMAD2/3信号通路，促进CRC转移(图5k)，为转移性CRC的机制提供了新的认识，并为晚期CRC提供了新的潜在治疗靶点。
参考文献：
Wu Nan., Jiang Mingzuo., Liu Haiming., Chu Yi., Wang Dan., Cao Jiayi., Wang Zhiyang., Xie Xin., Han Yuying., Xu Bing.(2020). LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway. Cell Death Differ., undefined(undefined), undefined. doi:10.1038/s41418-020-0596-y