LINC00941促进大肠癌转移

    LINC00941是一种新的lncRNA，在肿瘤发生过程中表现出原发性和促转移行为。然而，其在转移性大肠癌中的作用仍不清楚。因此，小编给大家介绍发表于影响因子为10.717的“Cell Death & Differentiation”的文章“LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway”，旨在探讨LINC00941在大肠癌转移中的作用及其机制。

    在本文中，大肠癌中LINC00941表达上调，且上调LINC00941与预后不良有关。在功能上，LINC00941促进裸鼠的迁移和侵袭能力，加速肺转移。在机制上，LINC00941激活了大肠癌细胞中的EMT。LINC00941通过直接结合SMAD4蛋白MH2结构域并与β-TrCP竞争以阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信号通路，从而激活EMT。
技术路线：

结果：
1.LINC00941表达上调与大肠癌预后不良有关
    组织微阵列证实LINC00941在大肠癌组织中的扩增表达，LINC00941主要定位于细胞质（图1a），在大肠癌组织中表达上调（图1b）。Kaplan-Meier生存率和Cox比例风险分析表明，与低LINC00941表达水平的CRC患者相比，具有较高LINC00941表达水平的CRC患者的总生存时间（OS）显著缩短，表明较高的LINC00941水平是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素（图1c）。利用TCGA，我们发现LINC00941是一种转移和生存相关的lncRNA，与癌旁非肿瘤组织相比（图1d）在大肠癌组织中上调，并且与大肠癌患者的OS时间相关（图1e）。ISH染色进一步证实，LINC00941在肿瘤组织中的表达显著增高，在淋巴结转移灶中表达最高（图1f，g）。我们还比较了LINC00941在大肠癌细胞系（HT-29、HCT-116、SW480、SW620和LoVo细胞）和永生化正常结肠上皮细胞（FHC细胞）中的表达，发现LINC00941在所有研究的大肠癌细胞系中高表达，尤其是在高侵袭性大肠癌细胞系（SW620和LoVo）中与FHC细胞相比过表达，提示LINC00941在大肠癌的发生发展中起着致癌作用（图1h）。

2.LINC00941促进大肠癌细胞的迁移和侵袭能力，并激活EMT
    为了阐明LINC00941在大肠癌中的生物学意义，我们分别用携带LINC00941 cDNA或sh-LINC00941的慢病毒载体在HCT-116和LoVo细胞中过表达或沉默LINC00941。与对照组相比，HCT-116细胞中LINC00941的过表达显著增加了细胞的侵袭和迁移能力，而LoVo细胞中LINC00941的下调对细胞的侵袭和迁移能力有相反的影响（图2a，b）。用sh-LINC00941转染的LoVo细胞处理的裸鼠产生的肺转移结节较少，而用LINC00941过表达的HCT-116细胞处理的裸鼠比相应的对照组产生更多的肺转移结节（图2c，d）。此外，与对照组相比，接受HCT-116-LINC00941细胞的裸鼠的OS较短，而接受LoVo-ShLINC00941细胞的裸鼠OS更长（图2e）。这些数据表明LINC00941对CRC进展有促进作用。此外，LoVo Sh-LINC00941细胞表达下调，呈现出更多的上皮形态，而HCT-116-LINC00941细胞与相应对照组相比呈现出更多的成纤维细胞样形态（图2f，g），这表明LINC00941可能通过激活EMT促进结直肠癌转移。HCT-116-LINC00941显示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白质水平降低，但波形蛋白、纤维连接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白质水平增加（图2h，i）。相反，LoVo Sh-LINC00941细胞显示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白质水平增加，但波形蛋白、纤维连接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白质水平降低（图2h，i），进一步证实LINC00941至少部分通过调节EMT促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移。

3.LINC00941通过抑制SMAD4泛素化增强其稳定性
    LncRNAs通常通过RNA-蛋白相互作用影响基因表达。因此，我们进一步研究了可能与LINC00941相互作用的蛋白，以获得关于LINC00941诱导的EMT在CRC转移中的深入机制观点。RNA下拉分析表明SMAD4可以特异性结合LINC00941（图3a）。同时，SMAD4在LoVo Sh-LINC00941细胞中表达下调，在HCT-116-LINC00941细胞中上调（图3b）。一致地，SMAD4富集于生物素标记的LINC00941组中（图3c）。此外，通过琼脂糖凝胶电泳和RIP分析进一步验证了LINC00941和SMAD4之间的相互作用（图3d，e）。为了确定LINC00941和SMAD4的确切结合区域，我们构造了一系列截断的LINC00941和SMAD4结构。LINC00941的1465到1895核苷酸可以结合SMAD4，而SMAD4的MH2结构域和全长SMAD4可以结合LINC00941（图3f，g），表明LINC00941是SMAD4的结合伙伴。细胞质lncRNAs通常负责蛋白质修饰的转录后调节。LINC00941抑制导致SMAD4蛋白表达减少，而LINC00941过表达上调SMAD4（图3b）。此外，如LINC00941通过延长其降解半衰期来增强SMAD4蛋白的稳定性（图3h，i），这意味着LINC00941可以通过其蛋白质降解来调节SMAD4。由于SMAD4蛋白降解是通过泛素-蛋白酶体途径介导的，为了深入了解LINC00941诱导SMAD4降解的机制，我们用蛋白酶体抑制剂（MG132）处理LoVo-Sh-LINC00941细胞。通过Western blot分析确定，MG132显著恢复了LoVo-Sh-LINC00941细胞中的SMAD4蛋白水平（图3j），表明泛素蛋白酶体途径参与了LINC00941诱导的SMAD4降解。为了进一步验证这一发现，我们评估了LINC00941过表达和LINC00941沉默的CRC细胞中SMAD4的多泛素化。如预期，当LINC00941过表达时，SMAD4泛素化显著降低，而当LINC00941被沉默时，SMAD4泛素化显著增加（图3k，l）。综上所述，这些数据表明LINC00941可以通过抑制SMAD4在CRC中的泛素化而稳定SMAD4。

4.LINC00941通过与β-TrCP竞争抑制SMAD4泛素化
    鉴于SMAD4可被β-TrCP多泛素化和降解，我们评估了β-TrCP在大肠癌SMAD4泛素化和降解中的功能意义。在LoVo和HCT-116细胞中抑制β-TrCP的表达可以显著提高SMAD4蛋白的表达水平（图4a）。同样，在抑制了LoVo和HCT-116细胞中β-TrCP的表达后，通过免疫沉淀发现SMAD4蛋白泛素化水平显著降低（图4b）。接下来，我们发现缺少LINC00941显著增加了SMAD4和β-TrCP的结合（图4c）。相反，过表达LINC00941可以显著提高抑制SMAD4和β-TrCP的结合（图4d）。此外，我们进一步确定SMAD4和FL-SMAD4的MH2结构域可以结合β-TrCP（图4e），表明β-TrCP通过结合SMAD4和FL-SMAD4的MH2结构域来控制SMAD4的泛素化和降解。考虑到SMAD4和FL-SMAD4的MH2结构域可以结合LINC00941，我们假设LINC00941通过与β-TrCP竞争来抑制SMAD4泛素化。正如预期的那样，竞争性RNA下拉分析进一步证实了LINC00941和β-TrCP之间的竞争（图4e）。总之，这些数据证实了LINC00941可以通过与β-TrCP竞争来提高SMAD4蛋白的稳定性，从而防止SMAD4降解。

5.在转移性大肠癌中，TGF-β1上调LINC00941，并与SMAD2/3信号通路的激活有关
    TGF-β1/SMAD信号通路是EMT的一个关键调节因子，SMAD4是一个重要的辅因子。鉴于LINC00941对SMAD4的稳定性很重要，并且LINC00941包含预测的TGF-β1靶点，我们评估了LINC00941在TGF-β1/SMAD信号通路中的作用。结果表明，当用TGF-β1处理LINC00941沉默的细胞时，LINC00941水平显著升高，而当LINC00941过表达的细胞受到TGF-β1抑制剂disitertide的作用时，内源性LINC00941水平显著降低（图5a，b）。一致地，与对照组相比，TGF-β1处理增加了LINC00941沉默的细胞的侵袭和迁移能力，而TGF-β1受体的抑制减轻了LINC00941过表达细胞的侵袭和迁移能力（图5c，d）。此外，与对照组相比，用disitertide处理过表达的LINC00941细胞显示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白质水平增加（图5e，f）。相比之下，LINC00941沉默的细胞显示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白质水平降低，但波形蛋白、纤维连接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白质水平增加（图5e，f），进一步证实TGF-β1参与了LINC00941诱导的EMT。更重要的是，荧光素酶报告分析显示，荧光素酶活性在使用TGF-β1处理后显著增加（图5g）。用LoVo Sh-LINC00941细胞和TGF-β处理的裸鼠产生更多的肺转移结节，而HCT-116-LINC00941细胞和disitertide处理的裸鼠比相应的对照组产生更少的肺转移结节（图5h，i）。此外，与对照组相比，用LoVo Sh-LINC00941细胞和TGF-β处理的裸鼠的OS较短，HCT-116-LINC00941细胞和disitertide处理的裸鼠的OS较对照组长（图5j）。这些数据证实了TGF-β1与LINC00941有很强的相互作用。

结论：
    我们的研究证实，LINC00941通过阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信号通路促进大肠癌的转移，为进一步研究转移性大肠癌的机制和新的潜在治疗靶点提供了新的视角。