类风湿与肠道菌群不可告人的秘密

肠道菌群近年来逐渐成为研究热点，并在许多生命过程中发挥着重要的作用，例如参与自身免疫进程，与神经发育的联系。近期，微生物顶级期刊Microbiome发表了一篇题名为：单一细菌种恢复微生物生态失调，保护大鼠模型骨骼免受类风湿破坏的文章。该文章主要通过宏基因组鸟枪法测序和宏基因组关联研究，评估了干酪乳杆菌对佐剂诱导关节炎大鼠模型肠道微生物群和免疫功能紊乱的影响。

   对类风湿性关节炎（RA）患者进行早期治疗是优化药物治疗成功的关键，目前在关节炎前期阶段阻断骨质破坏进展的治疗效果仍然不能令人满意。RA患者的微生物紊乱通过有效干预治疗显着逆转。将异常肠道微生物组调节到健康状态是预防骨损伤的潜在治疗方法。
技术路线：

结果：
1.干酪乳杆菌显著减轻佐剂诱导的关节炎
  对SD大鼠灌喂干酪乳杆菌菌株ATCC334和甲氨蝶呤(MTX)，在同一天用完全弗氏佐剂（CFA）进行关节炎造模。经过三十天干预后，用干酪乳杆菌和MTX治疗的大鼠表现出较少的症状加剧。此外，干酪乳杆菌发挥其抗关节炎作用而不迁移到肠道以外的地方，因为干酪乳杆菌是兼性厌氧细菌，并且在干酪乳杆菌处理的动物中未检测到菌血症。通过微型CT发现干酪乳杆菌处理的大鼠的踝部的骨侵蚀减少，膝关节的组织切片观察结果与微型CT一致，并且干酪乳杆菌处理的大鼠膝关节的病理评分和踝关节的放射学评分显着改善。这些数据表明，干酪乳杆菌的给药能够减轻实验性关节炎并保护骨骼免受侵蚀。

Fig1.干酪乳杆菌减轻佐剂诱导的大鼠关节炎。显示干酪乳杆菌对关节炎评分（a）和增加的后爪体积（b）的影响（每组n = 7）。a和b的数据被示为平均值±SEM，不同组的数据通过双向ANOVA分析组间差异（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。脚踝的照片，X射线和微CT图像显示在c中。在d中显示了不同组中大鼠膝关节病理切片的代表性图像。通过病理学评分e评估病理结果。分别使用micro-CT图像和micro-CT分析仪评估放射学评分和微CT评分（f，g）。在数据e，f，和g被示为平均值±SEM，组之间的差异通过单向ANOVA进行分析。（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。骨破坏水平的积分评估显示在（h）。数据显示为平均值并分为几个级别。0-0.2：正常; 0.2-0.4：轻微（Lig）; 0.4-0.6：中等（Mod）; 0.6-0.8：严重（Sev）; 0.8及以上：非常严重。正常，正常控制; 模型，疾病控制; MTX，甲氨蝶呤
2.干酪乳杆菌可预防由关节炎诱导引起的肠道生态失调
   由于缺乏明确定义的RA相关微生物群特征，因此选取五个时间点（TP）收集了四组的粪便样本，并通过使用鸟枪法宏基因组测序确定了关节炎发展过程中微生物组的动态变化。五个TP包括第0天，AIA诱导前（TP1），第7天（关节炎前时间点）（TP2），第14天（TP3），第21天（TP4）和第30天（TP5）。在TP3，表明干酪乳杆菌可以在早期补救挥发性肠道生态失调。在TP5，伴随着在干酪乳杆菌组中观察到的关节炎的缓解，肠道微生物组的组成显着接近HP而不是DP表明关节炎中的生态失调可以被干酪乳杆菌逆转，最终有助于改善肠道菌群。关节炎评分与HP的距离呈正相关（Spearman相关系数= 0.48，P = 0.015），与DP的距离呈负相关（Spearman相关系数= -0.46，P = 0.019）。

Fig2.随着时间的推移，干酪乳杆菌 / MTX处理的大鼠肠道微生物群组成的动态变化。显示了在5个时间点上对于干酪乳杆菌/ MTX处理的大鼠的每个样品的健康平面（HP）和模型平面（DP）的距离。线条的颜色对应于不同的样品，厚度反映了关节炎的严重程度。通过配对t检验分析HP和DP之间的差异
3.干酪乳杆菌治疗佐剂诱导关节炎（AIA）大鼠中紊乱的微生物组
  选择了25种微生物，其中毛螺菌，奇异变形杆菌和棒状杆菌支原体已发现可能与RA相关。通过标准化处理所鉴定的25种微生物的相对丰度，然后与TP1相比，在每个TP处显示Log10倍数的变化。
  进一步研究了干酪乳杆菌处理的AIA大鼠中关节炎相关菌种的改变。与模型组中的大鼠不同，包括不动杆菌，干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的微生物群被上调，并且解脲支原体，脱硫弧菌和二硫化嗜血杆菌细菌被下调。值得注意的是，这些改变发生在干酪乳杆菌ATCC334没有持续定植的情况下，因为我们没有检测到从干酪乳杆菌处理的大鼠分离的粪便样品中干酪乳杆菌的富集。然而，其他乳酸杆菌种类相对丰度上调或恢复到正常水平，这表示干酪乳杆菌在抑制关节炎中的功能与其调节微生物组，特别是其他乳杆菌菌株的功能密切相关。

Fig3.Log10与TP1的样品进行比较关节炎相关物种中的TP5的相对丰度的倍数变化。框表示第一和第三四分位数之间的中位数和四分位数间（IQR）; 胡须代表从第一或第三四分位数的1.5倍IQR内的最低值或最高值。圆圈代表样本。重要的倍数变化标有星号
4.抑制促炎细胞因子的表达与受干酪乳杆菌给药影响的细菌的丰度相关
  细胞因子在RA的发病机制中起关键作用，因此，确定血清中IFN-γ，TNF-α和IL-1β，IL-17，IL-2和IL-6的水平并确定干酪乳杆菌治疗AIA大鼠后促炎细胞因子水平与肠道微生物群改变的相关性。结果显示，与造模组AIA相比，干酪乳杆菌处理的AIA大鼠中促炎细胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-17和IL-6的水平显着降低。干酪乳杆菌处理的动物中，分别由活化的适应性和先天性免疫细胞产生的IL-17和IL-1β水平显着降低。这些结果表明干酪乳杆菌对AIA大鼠的作用与治疗相关微生物对促炎细胞因子表达的抑制作用相关。

Fig4.干酪乳杆菌通过嗜酸乳杆菌的复活抑制促炎细胞因子的表达。a使用ELISA评估血清中细胞因子（IL-17，IL-1β，TNFα，IL-6，IFN-γ，IL-2）的表达。数据显示为平均值±sem和min，max。通过单向ANOVA分析组之间的差异。（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。b 嗜酸乳杆菌丰度与血浆细胞因子的关系。cc，Spearman在调整体重，组和关节炎评分后的相关系数
5. 干酪乳杆菌保持氧化还原平衡参与AIA大鼠RA的改善
  为了探索干酪乳杆菌给药有益效果背后的潜在机制，使用KEGG数据库对L. casei和MTX处理的大鼠的肠道微生物组中的功能模块进行了综合分析。与微生物群的改变导致宿主代谢和氧化还原平衡变化的观点一致，发现磷酸戊糖途径的功能模块，包括氧化阶段，在AIA大鼠中得到增强，这与先前有关RA患者报告的结果一致。用干酪乳杆菌治疗后，磷酸戊糖途径中涉及的丰富基因减少，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）醌氧化还原酶，同化硫酸盐还原，NADH泛醌氧化还原酶，β-氧化和脂肪酸生物合成模块中涉及的丰度基因增加，表明干酪乳杆菌通过调节免疫代谢和氧化还原能力发挥其抗关节炎作用。

Fig5.干酪乳杆菌维持氧化应激的氧化还原平衡。与来自MTX，干酪乳杆菌和模型组的TP1样品相比，TP5处免疫相关KEGG模块的丰度的平均log 2倍变化。KEGG orthology group模块和组按无监督层级聚类排序。青色，减少模块; 红色，增加模块。未绘制一个或多个组中缺少的模块
结论
      通过在AIA大鼠中使用时间序列研究方案来鉴定肠道微生物组的组成和功能改变，并且结果支持调节微生物群可以作为预防和治疗人类RA的新策略的结论。这些结果是在实验性关节炎大鼠模型中获得的，并且非常需要在RA患者中进行深入研究。必须进一步阐明益生菌的预防/治疗作用背后的精确分子机制，并且需要对肠中鉴定的细菌标记物进行集中验证。这为RA研究和治疗提供了新的研究方向和治疗思路。