CRISPR单细胞测序（Perturb-seq）

CRISPR单细胞测序（Perturb-seq）

CRISPR单细胞测序（Perturb-seq）：是一种将CRISPR文库筛选与单细胞转录组测序（scRNA-seq）相结合的创新性技术，能够在单细胞分辨率下系统性解析基因功能、调控网络及疾病机制。

图1 Perturb-Seq 测序原理^[1]

 技术原理：通过CRISPR文库对目标基因进行大规模扰动，并利用单细胞测序技术全面捕获每个细胞的转录组变化，可实现同时检测多个不同细胞基因敲除/激活造成的基因转录本变化情况。

一、CRISPR单细胞测序应用案例

1、筛选胰岛素分泌及2型糖尿病的功能性基因

要系统性地表征2型糖尿病（T2D）遗传结构背后的基因和通路，需要可扩展的功能基因组学方法。通过CRISPR扰动获得的分子信息能够有效揭示尚未充分研究的基因所产生的机制效应。因此，作者针对人类胰岛β细胞（EndoC-βH1）中61个与2型糖尿病相关的基因和40个核糖体相关质量控制（RQC）基因，进行CRISPR文库（Perturb-seq）的单细胞RNA测序，以探究胰岛素分泌及2型糖尿病的病理机制。作者鉴定出21个功能性基因，其中包括尚未报道过的 KLHL42和ZZEF1。

图2 人类β细胞中Perturb-seq与T2D易感基因的功能筛选^[2]

图3 EndoC-βH1细胞中有效扰动基因hallmark基因集富集得分^[2]

2、筛选22q11.2染色体缺失综合征相关基因下游靶点

22q11.2染色体缺失综合征是一种由于染色体部分缺失所导致的遗传性疾病，在该段染色体中共含有37个基因，其中29个在大脑前额叶皮质中表达，临床上患者通常表现为精神分裂症或自闭症。为了深入研究其中哪些基因是致病的关键基因，研究者构建了靶向这29个基因的CRISPR文库，通过流式分选神经细胞以及单细胞测序分析不同细胞间的转录组变化（图4），他们发现Dgcr8、Dgcr14、Gnb1l和Ufd1l 基因敲除的各类型神经细胞中，其转录本均发生明显变化（图5 C）。通过比对这些基因敲除后的神经细胞与22q11.2染色体缺失小鼠模型中神经细胞的转录本差异，研究者们也进一步确认Dgcr8和Gnb1l基因缺失与该疾病的发展具有明显相关性^[3]。

图4 22q11.2染色体缺失综合征相关基因单细胞CRISPR文库技术路线^[3]

图5 不同基因敲除细胞表达谱变化^[3]

3、分析SWI/SNF复合物中不同基因/亚基的功能

哺乳动物SWI/SNF复合物（BAF）是由29个基因调控表达的10—15个亚基组合而成，该复合物对DNA的可及性以及基因的表达具有重要作用，然而复合物中不同亚基对调控基因表达的贡献仍不明晰。Cigall 等人针对该复合物中的28个基因设计了CRISPR敲除文库，通过慢病毒转染MOLM-13细胞，并结合流式分选以及单细胞测序技术进行分析后，揭示了该复合物中不同亚基对DNA可及性以及基因表达的作用。由于BAF复合物存在3种不同的形式（cBAF、PBAF和ncBAF），作者对这三种不同形式的复合物对应的基因表达谱分别进行分析，发现PBAF对基因表达的影响最小，而cBAF对发育和分化相关基因的表达调控影响最大^[4]。

图6 SWI/SNF复合物单细胞CRISPR文库技术路线^[4]

图7 不同基因、复合物亚型表达谱变化^[4]

4、筛选CD8⁺毒性T细胞分化相关基因

CD8⁺毒性T细胞（CTL）是抗肿瘤反应中的主要免疫细胞，其中，Tex细胞是CTL的主要群体，能直接杀伤肿瘤细胞，但是Tex增殖能力有限；相比而言，Tex细胞的前体细胞Tpex能分化产生大量的Tex细胞。然而，Tpex到Tex细胞分化的基因调控网络尚未被完全理解。为探究上述问题，研究人员构建了靶向180个细胞命运决定相关转录因子的CRISPR敲除文库的CTL细胞， 在将文库细胞转入黑色素瘤小鼠一周后，通过流式分选出剩余细胞，并进行单细胞测序。通过细胞分化相关基因对细胞进行分群以及pesudotime分析后，研究团队将细胞分为逐级分化的4个类群，即Tpex1、Tpex2、Tex1和Tex2。比较分析不同细胞类群中sgRNA富集信息，团队发现Ikzf1基因能够促使Tpex1退出静息状态，促进Tpex1细胞分化为Tpex2细胞；同时，Ets1基因则负向调控Tpex2分化为Tex1细胞，抑制Tpex细胞的分化；而Tex1细胞分化为Tex2细胞则依赖于Rbpj基因的激活^[5]。总的来说，该团队通过单细胞CRISPR文库技术发现并建立了Tpex细胞分化为Tex细胞过程中的关键调控通路。

图8 单细胞CRISPR文库筛选细胞分化相关转录因子^[5]

图9 Pesudotime分析以及各细胞群中sgRNA富集信息^[5]

二、服务流程

1、实验设计与前期准备

1.1明确科学问题（如癌症耐药机制、神经发育调控等），确定研究范围（全基因组筛选vs通路特异性筛选）

1.2 sgRNA文库设计

1.3 模型选择：细胞系（需验证编辑效率）、原代细胞、类器官； 体内AAV递送。

2、CRISPR文库构建与病毒包装

3、慢病毒感染及细胞筛选

4、单细胞文库构建

5、高通量测序及生信信息分析

三、参考文献

[1] Dixit A, Parnas O, Li B, Chen J, Fulco CP, Jerby-Arnon L, Marjanovic ND, Dionne D, Burks T, Raychowdhury R, Adamson B, Norman TM, Lander ES, Weissman JS, Friedman N, Regev A. Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens. Cell. 2016 Dec 15;167(7):1853-1866.e17.

[2] Nan J, He X, Liu X, Ran J, Chen J, Li P, Liu D, Sun Y, Shan A, Jiang X, Xie J, Wang W, Ning G, Cao Y. Single-cell perturbations decipher ribosomal stress-surveillance regulators in type 2 diabetes. Nat Metab. 2026 Jan;8(1):139-158.

[3] Santinha AJ, Klingler E, Kuhn M, Farouni R, Lagler S, Kalamakis G, Lischetti U, Jabaudon D, Platt RJ. Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq. Nature. 2023 Oct;622(7982):367-375.

[4] Otto JE, Ursu O, Wu AP, Winter EB, Cuoco MS, Ma S, Qian K, Michel BC, Buenrostro JD, Berger B, Regev A, Kadoch C. Structural and functional properties of mSWI/SNF chromatin remodeling complexes revealed through single-cell perturbation screens. Mol Cell. 2023 Apr 20;83(8):1350-1367.e7.

[5] Zhou P, Shi H, Huang H, Sun X, Yuan S, Chapman NM, Connelly JP, Lim SA, Saravia J, Kc A, Pruett-Miller SM, Chi H. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 2023 Dec;624(7990):154-163.