靶向LSD1通过NF2-Hippo-YAP途径抑制黑色素瘤转移

         黑色素瘤起源于皮肤黑色素细胞的恶性变化，具有高度转移性，但目前仍缺乏有效的治疗方法来防止其扩散。LSD1作为表观遗传修饰因子；然而，它在黑色素瘤中的作用尚未完全阐明。在本研究中，我们发现相对于原发性黑色素瘤，LSD1在转移性黑色素瘤中的表达上调。随后的实验表明，在体外和体内模型中，靶向LSD1都能有效抑制黑色素瘤的转移。从机制上讲，LSD1的药理学或遗传抑制诱导了YAP的磷酸化和随后的降解，YAP是Hippo信号通路的一个关键组成部分，与肿瘤转移密切相关。此外，ChIP-qPCR分析表明LSD1抑制增强了NF2和LATS1/2启动子区域的H3K4me2修饰，从而促进了它们的转录激活。这导致NF2和LATS1/2的表达增加，最终激活Hippo通路。这些发现不仅增强了我们对黑色素瘤转移的分子机制的理解，而且为开发LSD1抑制剂和黑色素瘤靶向治疗策略奠定了新的理论基础。本文于2026年5月发表于Cell Death and Disease（IF=12.2）上。

技术路线：

结果：

1）靶向LSD1抑制黑色素瘤细胞迁移

         根据我们之前的研究，我们已经确定LSD1表达升高与肿瘤转移有关。通过分析来自TCGA的数据集，我们发现LSD1表达在转移性黑色素瘤患者的肿瘤样本中显著上调（图1A），并且LSD1 mRNA水平升高与预后不良相关（图1B）。此外，通过免疫组织化学分析黑色素瘤患者样本以评估LSD1蛋白水平，发现肿瘤转移后LSD1表达明显上调（图1C，D）。为了研究LSD1在黑色素瘤细胞中的作用，我们使用了LSD1抑制剂ORY-1001。我们采用SRB实验评估药物治疗后A375、A875和B16细胞的活力。ORY-1001对A375、B16和A875细胞的IC50值分别为31.11±5.56 μM、40.18±6.35 μM和102.80±6.10 μM（图1E）。用不同浓度的ORY-1001处理A375、A875和B16细胞，检测EMT相关蛋白的表达。结果发现，ORY-1001以浓度依赖性方式降低了N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白的表达（图1F）。为了进一步评价ORY-1001对细胞迁移的影响，我们采用划痕法检测黑色素瘤细胞划痕损伤修复能力的变化。结果显示，与对照组相比，ORY-1001处理的细胞表现出更小的细胞划伤愈合面积和更低的迁移能力（图1G）。同样，Transwell实验证实，ORY-1001显著损害了黑色素瘤细胞的迁移能力（图1H）。与这些发现一致，在B16和A875细胞中，使用siLSD1敲除LSD1也能显著抑制EMT相关蛋白的表达并抑制迁移（图1I-K）。这些结果表明，抑制LSD1，无论是药理学上还是遗传学上，都能有效地抑制黑色素瘤细胞的转移潜力。

2）靶向LSD1通过下调YAP表达抑制黑色素瘤细胞迁移

         在我们团队进行的另一项研究中，LSD1的抑制与肺癌恶性进展期间YAP的同时下调有关。因此，这促使我们研究YAP是否介导LSD1驱动的黑色素瘤转移。首先，我们评估了YAP在黑色素瘤转移中的作用。我们通过免疫组织化学分析检测了YAP在患者中的表达；结果显示，转移灶中YAP表达明显增强（图2A，B）。为了阐明YAP在黑色素瘤转移中的作用，我们在B16和A875细胞中下调YAP或异位过表达YAP (OE YAP)（图2C，D）。结果显示，YAP敲低显著降低了B16和A875细胞中N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的蛋白表达（图2C），而YAP过表达则具有相反的效果（图2D）。同样，与对照组相比，YAP敲低导致抓伤愈合面积变小，迁移能力减弱（图2E，F），而YAP过表达增强了细胞运动性（图2G，H）。上述结果表明，YAP的表达显著控制黑色素瘤细胞的迁移。其次，为了研究LSD1抑制剂ORY-1001是否通过YAP影响黑色素瘤转移，我们检测了其对黑色素瘤细胞中YAP蛋白表达的影响。结果显示，ORY-1001在A375、A875和B16细胞中以浓度依赖的方式增加了YAP磷酸化并降低了YAP蛋白表达（图2I）。同样，LSD1的敲低也下调了YAP的表达（图2J）。相比之下，YAP敲低和YAP过表达都没有改变LSD1的表达水平（图2K）。这些结果支持了本研究中LSD1调控YAP蛋白丰度。我们进一步研究了YAP过表达是否会抵消LSD1对黑色素瘤细胞迁移的调节作用。结果显示，YAP过表达逆转了ORY-1001对黑色素瘤细胞中EMT相关蛋白表达的抑制作用（图2D）。更有趣的是，YAP过表达完全恢复了被ORY-1001抑制的划痕伤口愈合能力和迁移能力（图2G，H）。以上结果表明LSD1通过调节YAP的表达来调节黑色素瘤细胞的迁移。

3）靶向LSD1通过激活Hippo通路降低YAP表达

         qPCR分析显示，LSD1的敲低或抑制并未改变B16和A875细胞中YAP mRNA的水平（图3A，B），表明LSD1在转录水平上不调节YAP的表达。敲除LSD1可显著降低YAP蛋白的表达（图3C）。此外，MG132处理显著积累了LSD1和YAP蛋白，使用siLSD1可以减轻这种效应（图3C）。这些发现表明LSD1抑制可能促进YAP磷酸化和随后的蛋白酶体降解。为了进一步探讨LSD1对YAP核易位的影响，我们进行了核细胞质分离实验。结果表明，ORY-1001显著降低了细胞核中YAP的表达（图3D），表明ORY-1001促进了YAP的磷酸化和降解，从而限制了YAP进入细胞核。YAP主要受Hippo通路调控，是该通路下游的主要转录效应因子。接下来，我们进一步探究ORY-1001是否通过激活Hippo通路调控YAP磷酸化。结果显示，ORY-1001以浓度依赖的方式增加了LATS1、LATS2和p-LATS的蛋白水平（图3E）。通过敲低LSD1也获得了类似的结果（图3F）。此外，ORY-1001增加了p-YAP表达，同时降低了总YAP表达，这种作用被敲低LATS1/2逆转（图3G）。此外，ORY-1001显著抑制了细胞的迁移能力，这一作用通过敲低LATS1/ 2而部分逆转（图3H，I）。这些发现共同表明，靶向LSD1通过激活Hippo通路调节YAP表达和黑色素瘤细胞迁移，从而抑制黑色素瘤细胞迁移。

4）靶向LSD1可促进LATS1/2转录激活

          以上结果表明，Hippo通路是LSD1调控YAP表达和黑色素瘤细胞迁移的关键机制。鉴于LSD1的抑制显著提高了LATS1和LATS2的蛋白水平（图3E， F），我们进一步研究了LSD1对LATS1和LATS2表达的调控作用。如图4A、B所示，在B16和A875细胞中，敲低LSD1可显著提高LATS1蛋白水平，但不改变其半衰期。qRT-PCR分析显示，LSD1抑制或敲低后，LATS1/2 mRNA水平上调（图4C，D），表明LSD1抑制促进了LATS1和LATS2的转录激活。这些结果共同表明LSD1在转录水平上调控LATS1的表达。我们通过ChIP-qPCR验证了LSD1对LATS1和LATS2的表观遗传调控。在LATS1和LATS2基因转录起始位点周围设计引物，长度从−1000到+400 bp不等（图4E，F）。首先，使用LSD1特异性抗体的ChIP-qPCR证实LSD1直接结合LATS1和LATS2的启动子区域。值得注意的是，与对照组相比，ORY‑1001治疗显著降低了这些启动子处LSD1的富集（图4G）。我们使用H3K4me2特异性抗体进行ChIP-qPCR实验，以确定LSD1是否直接影响LATS1/2启动子区域的H3K4me2水平。如图4H，I所示，与对照组相比，经LSD1抑制剂处理的细胞LATS1启动子区域（-473 bp, -122 bp）和LATS2启动子区域（-878 bp, -534 bp）的DNA富集显著增加。这些结果表明，LSD1抑制促进了LATS1/2启动子区域H3K4me2的修饰，导致其转录激活。

5）LSD1通过上调NF2表达调控Hippo通路

         据报道，由肿瘤抑制基因NF2编码的NF2蛋白是Hippo通路的上游激活因子。因此，我们探讨NF2是否在LSD1调控Hippo-YAP通路中发挥作用。不同浓度的ORY-1001处理A375、A875和B16细胞，检测NF2蛋白水平。结果表明，ORY-1001以浓度依赖性的方式增加NF2蛋白的表达（图5A）。同样，LSD1的敲低也上调NF2蛋白的表达（图5B）。相反，虽然敲除NF2增加了YAP的表达，但不影响LSD1的表达水平（图5C）。这些结果表明，黑色素瘤细胞中LSD1的表达不受NF2的调节。为了进一步探索NF2在激活LSD1抑制剂介导的Hippo通路中的作用，我们用siNF2转染B16和A875细胞，检测Hippo通路相关蛋白的变化。结果显示，ORY-1001显著激活Hippo通路，p-LATS蛋白表达上调，YAP蛋白表达下调（图5D）。然而，NF2的敲低抑制了Hippo通路的激活，并显著逆转了ORY-1001对Hippo通路和YAP表达的影响（图5D）。这些结果表明LSD1抑制剂通过激活Hippo通路和NF2抑制YAP表达。接下来，我们探讨了siNF2对LSD1调控EMT相关标志物的影响。如图5E所示，与对照组相比，NF2的敲低导致N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的上调，并逆转了ORY-1001对黑色素瘤细胞中这些EMT标记物的抑制作用。然后，我们使用伤口愈合实验和transwell细胞迁移实验来评估细胞迁移能力。结果显示，NF2的下调显著促进了细胞迁移，抵消了LSD1抑制剂对黑色素瘤迁移的抑制作用（图5F，G）。以上结果表明，ORY-1001通过上调NF2表达调控Hippo通路，从而抑制YAP表达，抑制黑色素瘤细胞迁移。

6）靶向LSD1可促进NF2转录激活

         随后，我们利用蛋白合成抑制剂CHX探讨了LSD1对Merlin的调控作用。如图6A，B所示，敲低LSD1可显著提高Merlin蛋白水平，但不改变其半衰期。我们还观察到，在LSD1抑制或敲低后，Merlin的mRNA水平增加（图6C，D）。这些结果表明LSD1抑制在转录水平上促进了Merlin的表达。为了确认LSD1是否直接结合NF2的启动子区域并调节H3K4me2的水平，我们分别用LSD1抗体和H3K4me2抗体进行了ChIP实验。引物设计在NF2基因转录起始位点−1000 ~ + 400bp的区域（图6E）。使用LSD1特异性抗体的ChIP-qPCR实验表明，ORY- 1001抑制LSD1与LATS1/2启动子区域的结合（图6F）。使用H3K4me2特异性抗体的ChIP-qPCR实验显示，与对照组相比，使用LSD1抑制剂处理的细胞中NF2启动子区域（- 820 bp, - 683 bp）和（- 520 bp, - 382 bp）的DNA富集显著增加（图6G）。这些结果表明，LSD1抑制促进NF2启动子区域的H3K4me2修饰，导致其转录激活。

7）体内LSD1通过NF2-Hippo-YAP轴调控黑色素瘤转移

         在体外证实了siNF2、siLATS1和YAP的过表达促进黑色素瘤细胞的迁移并逆转了ORY- 1001的抑制作用后，我们试图在体内验证这些发现。利用NF2敲除（KO NF2）和YAP过表达（OE YAP）的B16细胞建立肺转移模型。如图7A所示，与载药组相比，ORY- 1001显著抑制了黑素细胞的肺转移。然而，在注射过表达YAP或缺乏NF2的细胞的小鼠中，黑色素瘤细胞的肺转移显著增强，这些操作明显逆转了ORY‑1001对肺转移的抑制作用。以上结果表明，ORY-1001在体内抑制黑色素瘤肺转移，为探讨LSD1和YAP在黑色素瘤患者中的临床意义，采用免疫组化方法检测黑色素瘤患者中LSD1和YAP的表达。如图7B、C所示，结果显示原发性和转移性黑色素瘤患者样本中YAP与LSD1蛋白水平呈正相关。YAP和LSD1水平呈正相关（图7D）。有趣的是，在TCGA的一个独立临床样本组中，KDM1A和YAP之间的关联也得到了证实。如图7E所示，在167例转移性黑色素瘤患者的肿瘤组织中，KDM1A与YAP呈正相关。然而，在局限性和复发性黑色素瘤患者的肿瘤组织中，KDM1A和YAP的表达不相关。这些发现共同支持LSD1通过NF2-Hippo-YAP轴调控黑色素瘤转移。

结论：

         本研究首次证实LSD1通过NF2-Hippo-YAP信号通路调控黑色素瘤细胞迁移和转移。LSD1抑制上调NF2和LATS1/2激活Hippo通路，导致YAP磷酸化和降解，最终抑制黑色素瘤细胞迁移和转移。这些发现不仅加深了我们对黑色素瘤转移的分子机制的认识，也为开发LSD1抑制剂和黑色素瘤靶向治疗提供了新的理论基础。

参考文献：

Yang H, Ding Y, Wang Y, Wei S, Cao W, Xu Y, He P, Chang L. Targeting lysine-specific demethylase 1 inhibits melanoma metastasis via the NF2-Hippo-YAP pathway. Cell Death Dis. 2026 May 16;17(1):626. doi: 10.1038/s41419-026-08872-1.