DNA甲基化检测

一、结合重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）

原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

该方法特点是：
1. 特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；
2. 灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
  
                   图1 结合亚硫酸盐的测序法流程图
DNA用重亚硫酸盐处理后进行PCR扩增，扩增片段纯化后连接进载体，转化大肠杆菌，过夜培养后挑单个阳性克隆进行测序。得到每个DNA分子特定区域甲基化位点的分布图。
 
结合重亚硫酸盐测序法技术实验流程
A．DNA制备
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重亚硫酸盐处理
C．DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．DNA脱磺基反应
E．PCR扩增
F．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化，随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。
 

二、甲基化特异性的PCR实验流程
（methylation-specific PCR, MSP）

原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。

该方法优点是：
1、检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA，可用于石蜡包埋样本；
2、快速、简单，省时；
3、如果结合Real-time定量PCR技术（Taqman 探针）则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。 

           图2 甲基化特异性的PCR（MSP）流程示意图
用亚硫酸盐处理后DNA分子发生了由甲基化状态决定的序列改变。用甲基化特异性的引物（primer M）和非甲基化特异性的引物（primer U）进行扩增。只有结合完全的甲基化或

MSP技术实验流程
A．DNA抽提
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B. 重亚硫酸盐处理
C．DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．DNA脱磺基反应
E．甲基化特异性的PCR反应
针对改变后的DNA序列设计两对引物（M，U），进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。
实例：
检测肝癌细胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后，针对改变的DAN序列设计两对引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp
 
图3：PCR扩增结果图

三、高分辨率熔解曲线（HRM）法 

     高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting ），简称HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型而及甲基化检测的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段长短、GC含量、GC 分布及单个碱基差异等物理性质不同而造成DNA 分子在加热变性时都会有不同的熔解曲线的形状和位置，并配合运用高浓度的饱和荧光染料，可以迅速的检测出核酸片段中GC含量和单碱基的突变。近年来，公司引进了Roche LightCycler® 480 II 和ABI VIIA7 全自动荧光定量PCR系统，为客户提供专业化、个性化的甲基化HRM检测服务。

操作流程：
﹡待测基因序列片段或位点甲基化引物设计（300bp以内）。
﹡利用甲基化转移酶修饰的DNA和非甲基化修饰的DNA制备标准品（0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度HRM标准曲线）
﹡亚硫酸氢盐处理样品DNA
﹡上机检测
﹡数据处理，形成报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
实验实例：
     对2个病例的某基因20个CG位点进行检测，分析出不同的甲基化程度。

四、焦磷酸测序法 

     焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是由4种酶（DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。

操作流程：
﹡DNA亚硫酸盐处理
﹡用焦磷酸测序专门引物设计软件设计甲基化引物
﹡进行PCR扩增预实验及正式实验
﹡PCR产物上焦磷酸测序仪检测
 
实验实例：

各种方案比较

服务说明
 
①样品要求：
﹡血液样品：样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝，样品量大于0.5 ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存，低温（≤-4℃）运输。
﹡组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）或石蜡包埋的组织，也可以是95%乙醇中固定的组织，组织量大于100 mg。
﹡DNA样品：纯度OD260/280 比值为1.8-1.9，浓度≥50ng/ul，体积≥50ul。
②提供详细的基因信息
     BSP方法要求待测序列≤300bp，HRM待测序列≤200bp，HRM待测序列≤200bp，焦磷酸测序待测序列≤60bp，且上下游保留200bp用于引物设计；MS方法要求提供待测序列的CG侯选位点。我们会根据客户的基因序列信息选择不同的检测方法，并在方案实验过程中随时与客户沟通。
③提供结果  
    实验报告（实验步骤，包括BSP法的5个克隆统计结果等)、PCR电泳照片、测序彩色波形图、HRM标准曲线图、焦磷酸测序原始文件、基因芯片的原始文件等。

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